Disrupción de la cutícula: un método para recolectar hemolinfa de larvas de Drosophila

- Para empezar, pipetea una gota de tampón en una almohadilla de disección limpia. Luego, coloque una larva viva seca en la gota. Drosophila, al igual que otros artrópodos, tiene un sistema circulatorio abierto en el que el corazón bombea hemolinfa por todo el cuerpo, bañando los órganos internos. Para liberar la hemolinfa, que es la combinación de sangre y líquido intersticial de los artrópodos, use fórceps y abra la cutícula, la cubierta exterior semirrígida de las larvas.

A continuación, deseche la carcasa y transfiera la solución de hemolinfa de la placa de disección a la solución tampón refrigerada en un tubo de microcentrífuga. Por último, use un hemocitómetro para contar el número de hemocitos, las células de la hemolinfa, que se recolectaron. En este protocolo, recolectaremos hemolinfa de larvas de Drosophila melanogaster.

- Comience la recolección de hemolinfa agregando 10 microlitros de 1x PBS a un tubo de microcentrífuga y colocando el tubo en hielo. A continuación, coloque una gota de 10 microlitros de 1x PBS en una almohadilla de disección limpia. Seleccione una larva individual y séquela colocándola sobre una toallita de teja. A continuación, transfiéralo a la gota de PBS en la almohadilla de disección.

Con unas pinzas, abra e invierta suavemente la cutícula para liberar la hemolinfa, y luego deseche el cadáver. Con una pipeta, recoja la hemolinfa de la almohadilla de disección. Agregue la hemolinfa al tubo de microcentrífuga PBS helado y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Cargue 10 microlitros de la muestra en una cámara de hemocitómetro y tome una lectura de concentración.