Drosophila Disección del músculo de vuelo indirecto (IFM) de la pupa tardía: un método para la recolección de tejido de alto rendimiento

- En la mosca adulta, los músculos de vuelo indirecto, o IFM, son los músculos más grandes de la mosca que abarcan todo el tórax. Los IFM orquestan los movimientos característicos de las alas de alta frecuencia en las moscas de dos alas, incluida la Drosophila. Dos grupos opuestos de fibras musculares comprenden los IFM.

En primer lugar, los músculos longitudinales dorsales, o DLM, se encuentran a lo largo del plano medio del tórax por encima del intestino y se extienden desde la parte anterior hasta la posterior. En segundo lugar, los músculos ventrales dorsales, o DVM, se extienden desde la parte superior hasta la parte inferior del tórax y están flanqueados por el TDT, o músculo de salto. Ambos grupos musculares están unidos a la cutícula.

Aproximadamente 48 horas después de la formación del pupario, o APF, los IFM maduros se pueden identificar visualmente con un microscopio de disección simple. En el protocolo de ejemplo, recopilaremos IFM de pupas de más de 48 horas de APF para el análisis de alto rendimiento.

- Para la disección de IFM después de 48 horas de APF, use un pincel ligeramente humedecido para transferir las pupas escenificadas a una tira de cinta adhesiva de doble cara montada en un portaobjetos de microscopio. Orienta las pupas en línea, con el lado ventral hacia abajo y anterior hacia la parte inferior del portaobjetos. Cuando se hayan colocado todas las pupas, use fórceps para separar y abrir la primera caja de pupa por encima de los espiráculos anteriores, y deslice suavemente un par de pinzas dorsalmente hacia la parte posterior, cortando la caja de la pupa a medida que las pinzas se mueven.

Libere la pupa de la caja abierta e inmediatamente transfiera la pupa a una gota de PBS en un segundo portaobjetos de microscopio. Cuando todas las pupas estén liberadas, usa unas tijeras finas para cortar el abdomen de las pupas lejos del tórax y empuja los abdómenes en una pila separada. Cuando se hayan extirpado todos los tórax, use un pedazo de papel de seda para eliminar la mayor parte del PBS y la pila de abdómenes.

Agregue una gota de PBS fresco y frío a los tórax restantes antes de usar las tijeras para cortar desde la cabeza a lo largo del eje longitudinal del cuerpo con un solo movimiento para dividir el tórax por la mitad. Cuando se hayan diseccionado todas las pupas, use las pinzas del número cinco para seleccionar una de las hemisecciones e inserte suavemente las puntas de una pinza por encima y por debajo de la mitad de las IFM.

Sosteniendo el primer par de pinzas quietas, use unas tijeras finas para cortar un extremo del IFM de la cutícula y los tendones antes de girar la pupa 180 grados para permitir que el otro extremo del IFM se corte libre de la cutícula y los tendones. Use pinzas para transferir el haz de IFM desde el tórax hasta el borde de la burbuja de PBS usando tensión de agua para mantener el haz en su lugar.

Luego, empuje la carcasa hacia el lado opuesto de la diapositiva y diseccione el resto de los IFM de la misma manera. Cuando se hayan recolectado todos los IFM, use las pinzas del número cinco para eliminar cualquier músculo de salto o fragmentos de cutícula que puedan haber llegado a las muestras. A continuación, utilice la tensión del agua para capturar suavemente los IFM disecados entre un par de pinzas y coloque los IFM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS refrigerado.