JoVE Encyclopedia of Experiments
Biología
0 vistas • 2:56 min • April 30th, 2023
- Transfiera la C. elegans lavada en líquido a un portaobjetos de vidrio previamente recubierto con polilisina, un compuesto que ayudará a que las cutículas de los gusanos se adhieran a la superficie del vidrio. Presione suavemente otra corredera de vidrio hacia abajo con un borde que sobresalga de la corredera inferior. Para inmovilizar a los gusanos sin dañarlos, comprima a los animales evitando cualquier movimiento lateral. Luego, coloque los portaobjetos de vidrio con gusanos intercalados en un bloque de metal dentro de un recipiente de laboratorio aislado lleno de un agente congelante, como nitrógeno líquido o hielo seco.
El metal es un conductor de temperatura eficaz que garantiza que la superficie del bloque esté lo suficientemente fría como para congelar rápidamente las cutículas del gusano en ambas superficies de vidrio. Una vez congelados, separe rápidamente los portaobjetos de vidrio para separar o abrir las cutículas de los gusanos. Proceda con la fijación y tinción del tejido, ya que la interrupción de la cutícula de baja permeabilidad permite que los fijadores químicos y los anticuerpos de tinción accedan a los tejidos del gusano interior. En el siguiente protocolo, veremos una demostración detallada de la técnica de congelación-craqueo y fijación de tejidos.
- Primero, prepara un portaobjetos para arreglar los gusanos. Pipetea 30 microlitros de poli-L-lisina en un portaobjetos y, a continuación, coloca un segundo portaobjetos en el otro y frótalos para esparcir la solución de manera uniforme sobre ambos. Ahora, despega los dos portaobjetos y déjalos secar al aire durante 30 minutos.
A continuación, coloque un bloque de metal plano en un recipiente lleno de nitrógeno líquido. Lave las placas con solución M9 y transfiera unos 10 microlitros de M9 que contienen los gusanos. Alternativamente, elija los gusanos y agregue M9 al portaobjetos.
Una vez que se transfieran los gusanos, deje caer suavemente un cubreobjetos transversalmente sobre ellos de modo que el cubreobjetos sobresalga de un borde. A continuación, presione suavemente el cubreobjetos sin hacer ningún movimiento lateral.
Ahora, transfiera inmediatamente el portaobjetos al bloque de metal en nitrógeno líquido y deje que se congele. Después de cinco minutos, retira el cubreobjetos con el borde que sobresale. Hazlo rápidamente para conseguir la grieta adecuada de la cutícula.
A continuación, sumerja el portaobjetos en un frasco de vidrio Coplin lleno de metanol a menos 20 grados centígrados. Después de cinco minutos, transfiera el portaobjetos a un frasco de vidrio Coplin lleno de acetona durante otros cinco minutos a la misma temperatura. Los portaobjetos se pueden teñir directamente o almacenar a menos 20 grados centígrados.