0 visualizaciones • 2:44 min. • April 30th, 2023
- Para el análisis de PCR de un solo gusano, permita que un gusano hermafrodita se autofecensure y ponga huevos que producirán descendencia genéticamente idéntica y, por lo tanto, conserve una copia de la cepa modificada. Luego, transfiera el padre a un tubo que contenga tampón de lisis de gusanos.
Congele el tubo a menos 80 grados centígrados para abrir la cutícula o la capa exterior. Caliente la muestra a más de 60 grados centígrados para lisar las células del gusano liberando las proteínas intracelulares junto con el ADN genómico de la célula. A esta temperatura, la proteinasa K dentro del tampón degrada las proteínas, particularmente las nucleasas que de otro modo destruirían el ADN genómico.
Luego, eleva la temperatura a 95 grados centígrados para inactivar la enzima. Finalmente, agregue el lisado celular a un tubo con una mezcla maestra de PCR compuesta por tampón de reacción, dNTP, cebadores directos e inversos para la región de interés, taq polimerasa y agua, llevando la reacción a un volumen final deseado. Para realizar la PCR, ejecute el programa termociclador adecuado que amplifique la región de ADN de interés.
En el siguiente ejemplo, veremos un procedimiento de PCR para detectar eventos de edición de CRISPR-Cas9 en el ADN genómico de gusanos F1 individuales.
- Después de 1 a 2 días de puesta de huevos, use una imagen de lombriz para transferir los F1 a tapas de tubos de tiras de PCR individuales que contengan 7 microlitros de tampón de lisis caliente. Centrifugar los tubos de PCR a máxima velocidad y temperatura ambiente durante un minuto para llevar a los animales al fondo del tubo. Luego, congele los tubos a menos 80 grados centígrados durante una hora.
A continuación, lise los gusanos congelados en un termociclador utilizando el siguiente programa. A continuación, configure una mezcla maestra de PCR como se muestra en esta tabla.
Agregue 21 microlitros de mezcla maestra de PCR en tubos de PCR limpios. A continuación, añadimos 4 microlitros del tubo de lisis de lombrices y mezclamos bien pipeteando.
A continuación, ejecute el programa de PCR siguiendo las directrices del fabricante.