Disociación unicelular de Caenorhabditis elegans: un método para aislar células vivas

- Comience con gusanos peletizados lavados y agregue un tampón de lisis que contenga SDS, un detergente, y DTT, un agente reductor. Esto rompe la cutícula protectora del gusano, exponiendo el cuerpo a la disociación celular. Evite la exposición prolongada al tampón de lisis para minimizar la lisis y la muerte celular.

A continuación, retire los reactivos de lisis con varios lavados de tampón de aislamiento en frío. Es importante que este tampón tenga la osmolaridad correcta para evitar la muerte celular. Utilice una enzima proteasa para descomponer las conexiones de célula a célula. Ayuda al proceso de homogeneización junto con la energía mecánica pipeteando la mezcla contra la pared del tubo.

Agregue medios que contengan suero para detener la reacción enzimática y antibióticos para prevenir la contaminación. Granule y lave la muestra varias veces para eliminar la mayoría de los residuos.

Finalmente, coloque el tubo sobre hielo para permitir la sedimentación por gravedad. Los desechos, incluidos los restos de la cutícula o los grupos de células, se asentarán, mientras que las células disociadas permanecen suspendidas en la capa superior del medio. Estas células se pueden utilizar para el cultivo a corto plazo o para aislar poblaciones celulares específicas mediante FACS o inmunoprecipitación.

En el protocolo de ejemplo, disociaremos gusanos transgénicos que expresan GFP en neuronas de interés para aislar y analizar esas células.

- Después de recoger los animales, centrifugarlos a 1.600 veces g durante cinco minutos. Retire todo el sobrenadante y vuelva a suspender los gusanos en 1 mililitro de medio M9. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Centrifugar a 1.600 veces g durante cinco minutos para pellet los gusanos. A continuación, añade 200 microlitros de tampón SDS-DDT e incuba a temperatura ambiente durante cinco minutos. Los gusanos ahora deberían parecer arrugados a lo largo del cuerpo si se observan con un microscopio óptico.

A continuación, agregue 800 microlitros de tampón de aislamiento helado y mezcle moviendo suavemente el tubo. Centrifugar a 13.000 veces g y a 4 grados centígrados durante un minuto para pellet los gusanos. Retirar el sobrenadante y lavar con 1 mililitro de tampón aislante.

Repita este proceso de centrifugación y lavado un total de cinco veces, asegurándose de quitar cuidadosamente el tampón de aislamiento cada vez. Después de esto, agregue 100 microlitros de mezcla de proteasa de Streptomyces griseus disuelta en tampón de aislamiento, al pellet.

Incube a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Asegúrese de aplicar la interrupción mecánica pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 60 a 70 veces con la punta de la micropipeta de 200 microlitros contra la parte inferior del tubo. Para determinar la etapa de la digestión, retire de 1 a 5 microlitros de la mezcla de digestión, colóquela en un portaobjetos de vidrio e inspecciónela con un microscopio de cultivo de tejidos.

Después de cinco a siete minutos, los fragmentos de gusano deben tener una cutícula visiblemente reducida y una mezcla de células será fácilmente visible. Detenga la reacción añadiendo 900 microlitros del medio L15 de Leibovitz disponible en el mercado suplementado con un 10% de FBS y penicilina-estreptomicina.

Centrifugar a 10.000 veces g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos para granular fragmentos y células aisladas. Lave las celdas peletizadas dos veces más con medios fríos suplementados con L15 utilizando 1 mililitro de medio por lavado. Vuelva a suspender las células peletizadas en 1 mililitro de medio suplementado con L15 y déjelas actuar en hielo durante 30 minutos.

Luego, tome la capa superior, que es de aproximadamente 700 a 800 microlitros, y transfiérala a un tubo de microcentrífuga. Utilice un contador de células automatizado o un hemocitómetro para medir la densidad celular de 10 a 25 microlitros de células aisladas.