0 visualizaciones • 3:24 min. • April 30th, 2023
- En C. elegans, el ARNi puede ser inducido alimentando a los gusanos con bacterias que expresan ARN bicatenario o dsRNA a partir de un plásmido de ADN recombinante.
Para empezar, cultive E. coli HT115 resistente a la tetraciclina transfectada con plásmido L4440 durante la noche en placas de agar LB selectivas que contengan tetraciclina y ampicilina, o su análogo funcional carbenicilina. Además del ADN diana, el plásmido contiene un gen para la resistencia a la ampicilina. Solo las colonias de bacterias que heredan el plásmido pueden crecer en presencia de estos antibióticos.
A continuación, coseche las colonias de bacterias y expándalas en medio LB líquido hasta la concentración deseada. Para inducir la expresión de dsRNA, transfiera la solución de bacterias a un medio de crecimiento de nematodos preparado, o NGM, placas de agar que contengan IPTG.
En este sistema de expresión, IPTG imita a la lactosa para inactivar el represor de lac, lo que permite la expresión de la ARN polimerasa T7. En el plásmido, la expresión del ADN diana está regulada por dos promotores T7 convergentes. En consecuencia, se transcriben secuencias sensoriales y antisentido que conducen a la expresión de dsR
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