JoVE Encyclopedia of Experiments
Biología
0 vistas • 3:15 min • April 30th, 2023
- Para empezar, agregue carbenicilina y un milimolar de IPTG para controlar y analizar los matraces de cultivo que contienen medios basales S. Haga girar un tubo que contenga larvas en la etapa de crecimiento uno, también llamadas larvas L1, durante unos minutos. Ahora retira el sobrenadante y coloca dos microlitros de L1s en una placa de agar. Coloque la placa bajo un microscopio de disección y cuente el número de larvas.
Añada bacterias de ARNi portadoras de un plásmido de ARNi inespecífico al matraz de control y bacterias con ARNi dirigido a genes al matraz de ensayo. La cantidad de bacterias añadidas debe ser proporcional al número de lombrices.
Deje que las larvas crezcan con agitación continua para asegurar una correcta oxigenación. Las larvas se alimentan de las bacterias. Dentro de la larva, el pequeño ARN interferente se une al ARNm complementario producido por el gen objetivo e inhibe la expresión de proteínas. Finalmente, examine los gusanos para determinar el fenotipo que le interesa.
En el protocolo de ejemplo, trataremos larvas L1 con ARNi dirigido al gen daf-2, en cultivo líquido.
- Para comenzar el tratamiento, agregue 207,45 mililitros de medio basal S con reactivos adicionales como se describe en el protocolo de texto adjunto a un matraz de cultivo de Fernbach de 2,800 mililitros. Añadir una concentración final de 50 microgramos por mililitro de carbenicilina y 1 milimolar de IPTG, y cerrar el matraz con un tapón de rosca de membrana.
Saque los L1 de la incubadora a 25 grados centígrados y transfiéralos a tubos de 15 mililitros. Centrifugar los L1 a 1.900 veces g durante tres minutos. Después de girar, retire el sobrenadante. Bajo un microscopio, cuente los L1 por dos microlitros y promedie los números obtenidos de al menos nueve gotas.
A continuación, agregue 50.000 gusanos para la colección de gusanos jóvenes y 100.000 gusanos para la colección de gusanos viejos en cuatro matraces de cultivo de Fernbach preparados en el paso anterior. A continuación, añada las bacterias de ARNi de control y las bacterias de ARNi para el gen de interés proporcionalmente al número de gusanos.
Después de agregar bacterias, complete el cultivo de lombrices con S basal para llevar el volumen total a 300 mililitros. Incubar el cultivo de lombrices a 25 grados centígrados en una incubadora agitadora a 150 RPM hasta la recolección.