Name: De un solo paso metabolómica: Hidratos de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos cuantificados en un procedimiento único (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprende metabolómica en un solo paso para cuantificar carbohidratos, ácidos orgánicos y aminoácidos mediante GC/MS. Este método mejora el cribado neonatal detectando un 38% más de trastornos metabólicos hereditarios.

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La asistencia técnica capaz de Anthony Thomas se agradece.

Procedimiento para el procesamiento de muestras de orina <ol><li> Descongele la muestra de orina en un baño de agua a 37 ° C. Decantar en un nuevo envase si el original está en peligro. </li><li> Tomar una alícuota máxima de 13 ml de muestra y almacenarla a -20 ° C en un tubo de centrífuga cónico de etiquetado. </li><li> Medir y registrar la densidad óptica de la muestra mediante la colocación de un par de gotas de orina en el refractómetro. </li><li> Filtrar la muestra a través de un filtro de 0,2 um. </li><li> Medir el volumen de muestra a continuación de acuerdo a la densidad óptica <table border="0"><tbody><tr><td> 1.000-1.009 </td><td> 1,00 ml </td></tr><tr><td> 1.010-1.019 </td><td> 0,50 ml </td></tr><tr><td> 1.020-1.050 </td><td> 0,25 ml + 0,25 ml de H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> El volumen específico se transfiere entonces a un Reactivial contiene las siguientes normas internas: 500 nanomoles (nmoles) 3 creatina, 10 nmoles d 3 El ácido metilmalónico, 100 nmoles de cada uno de los siguientes 13 C 3 de lactato, piruvato 3 13 C, 13 C 2 15 N glicina, serina 3 d, d 5 fenilalanina, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotato, d 4 ácido sebácico, 13 C 6 glucosa, inositol y 6 d d 5 triptófano. </li><li> 20 microlitros (l) de un 7,5 unidades / l de solución de ureasa (Calzyme Catálogo de laboratorios no. 116A0100) se añade a la muestra, que es vaciado y sellado en CO 2 a través de un tabique inerte. </li><li> La muestra se lleva a cabo a 37 ° C durante 30 minutos con más gas carbónico añadido a intervalos de 15 minutos para mantener la presión. </li><li> 20 l más de la solución de ureasa, se añade, el frasco se llena con dióxido de carbono, y la muestra se mantuvo a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> 500 l de acetona 30:70: se mezcla con metanol, el tapón de goma se sustituye por un tabique recubierto de teflón, y la muestra se enfría a -20 ° C durante 15 minutos. </li><li> Los sólidos son retirados por centrifugación a 1500 rpm x 10 minutos y luego se decanta en un lugar limpio Reactivial 2,0 cc (Supelco / Sigma) </li><li> Añadir trifluoroacetato trietilamonio (TEA / TFA) (Sigma) como sigue: <ul><li> 20 l de 1,00 ml de muestras </li><li> 40 ml de 0,5 ml o menos muestras, </li></ul></li><li> Rematar con acetonitrilo y de lugar en una corriente de nitrógeno a 70 ° C hasta que el volumen constante se logra (TEA / TFA seguirá siendo) (~ 15 minutos). </li><li> Repita el paso 13, hasta 4 veces hasta que se forma un precipitado (~ 10 minutos cada uno). </li><li> Deje enfriar durante unos 2 minutos. Rematar con cloruro de metileno, teniendo cuidado de hervir, y seco (~ 4:00 minutos). </li><li> Repita el paso 15. </li><li> Añadir MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (térmica Científica) a las siguientes tarifas: <ul><li> 150 l de 1,00 ml de muestras </li><li> 200 l de 0,50 ml o menos muestras, </li></ul></li><li> Cap en una atmósfera de nitrógeno y se incuba a 70 ° C durante 1 hora. </li><li> Traslado al microviales, bajo una atmósfera de nitrógeno, para el análisis de cromatografía de gases / espectrómetro de masas. </li><li> Microviales lugar para la inyección automatizada por el GC Agilent 5975 / TM: temperatura del instrumento son las siguientes: inyector 200 ° C, la interfaz de 250 ° C, horno de 80 º C durante 1 minuto; rampa a 4 º C / minuto 80-130 ° C, rampa 6 ° C / minuto 130-200 ° C, rampa de 12 ° C / minuto 200-285 ° C, mantenida durante 10 minutos. Columna: 25 m, 320 micras ID, 0,5 micrones espesor de la película DB-5. Espectrómetro de masas: fuente de 230 ° C, quad 150 ° C, escaneado 50-650 amu a 2,46 lecturas / seg. Solvente demora 3,5 minutos. </li></ol> Resultados representante Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">haga clic aquí</a> para ver los resultados representativos.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

El laboratorio de cribado metabólico es un laboratorio clínico con licencia CLIA propiedad de Saint Louis University, una corporación sin fines de lucro. El Dr. Shoemaker no se benefician directamente de los ingresos de laboratorio, pero podrían beneficiarse indirectamente de la productividad del laboratorio. Ninguno de los métodos, las técnicas, los resultados, los rangos normales, macros, las bibliotecas de software, o las conclusiones se consideran de propiedad y son de libre disposición de los interesados.

El método de la ureasa (1) ha sido citado 62 veces en la literatura médica con varias modificaciones. Grupo de Matsumoto (2,3) simplificó el procedimiento para el alto rendimiento de cribado neonatal e informó de los resultados de 16.000 pacientes. Kuhara y otros (4-7) han reportado el uso del método en varios casos de diagnóstico de errores innatos y seguimiento. Rhead (8) también confirmó la utilidad del método para el diagnóstico clínico y el seguimiento de los errores innatos. El método ha sido aplicado a la orina de los osos, ratones knock-out, los elefantes y los homogeneizados de moscas de la fruta entera y sus larvas (9). Los medios de cultivo de Cryptococcus antes y después de la mutagénesis dirigida también se analizaron, sin el paso de ureasa (10). El método ha sido aplicado a la evaluación de la nutrición humana en estudiantes de medicina, pacientes con síndrome de Down y demencia veteranos ancianos después de la carga de los sujetos con dosis orales de los aminoácidos triptófano, metionina e isoleucina (11). Los ocho vitaminas B se evaluó mediante la cuantificación de los productos de descomposición de los tres aminoácidos que, entre ellos, requieren que todos los 8 vitaminas en algún momento de su degradación. Los efectos tóxicos de los fármacos y su mitigación mediante el suplemento vitamínico se ha reportado (12). Muestras de líquido amniótico de embarazos con síndrome de Down normal y se analizaron e informaron (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computadora</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computadora</td></tr><tr><td>Ureasa</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>También Sigma C3</td></tr><tr><td>Estándares de Isótopos Estables</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disolventes</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analitos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columnas de GC</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>Viales</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

de un solo paso metabolómica: hidratos de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos cuantificados en un procedimiento único

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Cada niño nacido en los EE.UU. es ahora seleccionados para un máximo de 42 trastornos genéticos raros llamados &quot;errores congénitos del metabolismo&quot;. El método de detección se basa en la espectrometría de masas y cuantifica acilcarnitinas como una pantalla para acidemias orgánicas, así como las medidas de los aminoácidos. Todos los estados también realizan pruebas enzimáticas para los trastornos de los hidratos de carbono como la galactosemia. Debido a que los resultados pueden ser no específicos, pruebas de seguimiento de resultados positivos es necesario utilizar un método más definitivo. El presente informe describe la &quot;ureasa&quot; método de preparación de muestras para la detección de errores innatos. Enzima ureasa cristalina se utiliza para eliminar la urea de los fluidos del cuerpo que permite que la mayoría de los otros metabolitos solubles en agua para deshidratar y derivado de cromatografía de gases en un solo procedimiento. La deshidratación por evaporación en una corriente de nitrógeno se ve facilitada por la adición de acetonitrilo y cloruro de metileno. Entonces, trimethylsilylation lleva a cabo en la presencia de un catalizador único trifluoroacetato trietilamonio,. Inyección automatizada y es seguida por cromatografía de macro-impulsado cuantificación personalizadas de 192 metabolitos y semi-cuantificación de todos los componentes principales con las bibliotecas especializadas de espectros de masas de compuestos biológicos TMS derivado. El análisis se puede realizar en la plataforma Chemstation ampliamente utilizado con las macros y librerías disponibles por parte del autor. En nuestro laboratorio, más de 16.000 muestras de pacientes han sido analizados usando el método con un rendimiento diagnóstico del 17% - es decir, el 17% de los resultados de las muestras revelan los resultados que deben ser tramitadas por el médico solicitante. Se incluyen en estas más de 180 confirmados errores innatos, de los cuales aproximadamente el 38% no podría haber sido diagnosticado con los métodos anteriores.

El método de la ureasa de preparación de muestras para análisis GC / MS de metabolitos intermedios es presentado por su inventor. El método permite un paso de seguimiento de cribado neonatal de errores congénitos por espectrometría de masas en tándem de los hidratos de carbono cuantificar, orgánicos y aminoácidos a todos en un solo proceso.

De un solo paso metabolómica: Hidratos de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos cuantificados en un procedimiento único

Actualmente, todos los recién nacidos en los EE. UU. se someten a un cribado para detectar hasta 42 trastornos genéticos poco frecuentes denominados «errores innatos del metabolismo». El método de cribado se basa en...

En este procedimiento de metabolómica de un solo paso, las muestras biológicas se preparan para el análisis de carbohidratos, ácidos orgánicos y aminoácidos mediante espectrometría de masas con cromatografía de gases en un único procedimiento. Primero, las muestras se tratan con la enzima ureasa para eliminar la urea. El segundo paso del procedimiento consiste en deshidratar las muestras en presencia de un detergente compuesto por dos componentes volátiles: triationa, amonio y trifluoroacetato.A continuación, se realiza la derivatización de los componentes mediante trimetilación. Finalmente, el análisis por cromatografía de gases, espectrometría de masas en árbol, cuantificación automatizada de carbohidratos, ácidos orgánicos y aminoácidos, isol, glicina y azúcares amino permite confirmar y hacer seguimiento de la mayoría de los trastornos genéticos detectados en la cribado neonatal, así como de un 38 % adicional de trastornos que actualmente no se detectan mediante espectrometría de masas en tándem. Hola, soy Jim Shoemaker del Laboratorio de Cribado Metabólico de la Universidad de St. Louis.Estoy aquí para demostrar la metabolómica en un solo paso, un método para analizar fluidos biológicos en busca de metabolitos intermedios sin separar compuestos ácidos, básicos y neutros. Esto permite complementar el cribado neonatal por espectrometría de masas en tándem con un único procedimiento que permite analizar ácidos orgánicos, aminoácidos, carbohidratos, derivados de carbohidratos y glicina ACell, todo en una sola etapa. El resultado es que, en la gráfica detrás de mí, puede observarse que los diagnósticos indicados en rojo pueden realizarse mediante la metabolómica en un solo paso, pero no habrían sido detectados con el cribado neonatal actual mediante espectrometría de masas en tándem.Entonces, comencemos la demostración. Para iniciar este procedimiento, coloque la muestra de orina en un baño de agua a 37 grados Celsius. Si el recipiente original está dañado, transfiera una muestra a un recipiente nuevo.Tome una alícuota de la muestra y almacénela a menos 20 grados Celsius en un tubo cónico para centrífuga etiquetado como respaldo. A continuación, mida y registre la densidad óptica de la muestra colocando unas gotas de orina en el refractómetro portátil. Después de medir la densidad óptica, filtre la muestra a través de un filtro de 0,2 micrones.Mida el volumen de muestra según la densidad óptica medida antes de la filtración. Para valores entre uno y 1.009, utilice un mililitro de muestra; para valores entre 1.01 y 1.019, utilice 0.5 mililitros de muestra; y para valores entre 1.02 y 1.05, combine 0.25 mililitros de muestra con 0.25 mililitros de agua.Transfiera el volumen especificado a un vial reactivo que ya contenga los patrones internos marcados con isótopos especificados en la tabla mostrada aquí. Los patrones incluyen creatina, ácido metilmalónico, lactato, piruvato, glicina, fenilalanina, hexaol, glicina, orato, ácido SEBA, glucosa, inositol y triptófano. Luego agregue 20 microlitros de una solución de ureasa de 7,5 unidades por microlitro.Lave la muestra y selle bajo dióxido de carbono a través de un septo inerte. Incube la muestra a 37 grados Celsius durante 30 minutos, agregando más gas de dióxido de carbono a intervalos de 15 minutos para mantener la presión, al final de la incubación de 30 minutos, con 20 microlitros adicionales de la solución de ureasa. Lave el vial con dióxido de carbono y mantenga la muestra a 37 grados Celsius durante otros 15 minutos.Una vez finalizado el tratamiento con ureasa, proceda inmediatamente a deshidratar y derivatizar la muestra inmediatamente después del tratamiento con ureasa. Con 500 microlitros de una solución de acetona a metanol de 30 a 70. A las muestras, sustituya el septo de goma por un septo recubierto de teflón.Enfríe la muestra a menos 20 grados Celsius durante 15 minutos. Elimine los sólidos mediante centrifugación a 1500 RPM durante 10 minutos, y luego transfiera el sobrenadante a un vial reactivo limpio de 2,0 CC. A continuación, agregue triamonio trifluoroacetato o T-E-A-T-F-A, que es el catalizador para la trimetilación: 20 microlitros para muestras de un mililitro, y 40 microlitros para muestras de 0,5 mililitros o menos.Llene hasta arriba con acetonitrilo y coloque bajo una corriente de nitrógeno a 70 grados Celsius hasta alcanzar un volumen constante, lo que indica que solo queda T-E-A-T-F-A. Esto tarda aproximadamente 15 minutos. Nuevamente, llene hasta arriba con acetonitrilo y coloque bajo una corriente de nitrógeno a 70 grados Celsius hasta lograr un volumen constante, repitiendo hasta cuatro veces hasta que se forme un precipitado.Esto lleva aproximadamente 10 minutos cada vez después de la deshidratación; deje enfriar durante unos dos minutos. Complete con cloruro de metileno, teniendo cuidado de que no hierva en exceso, y seque. Esto lleva aproximadamente cuatro minutos.Llene hasta arriba con cloruro de metileno y seque. Una vez más. A continuación, derive la muestra.Añada 150 microlitros de OFM, STFA para muestras de un mililitro y 200 microlitros por 0,5 mililitro o menos. Tape las muestras bajo atmósfera de nitrógeno e incube a 70 grados Celsius durante una hora. Al finalizar la incubación de una hora, trabaje bajo atmósfera de nitrógeno para transferir las muestras a viales micro para su análisis en un espectrómetro de masas con cromatógrafo de gases; aquí se utiliza el GCMS Agilent 5 9 7 5 con una columna capilar DB cinco.Para la espectrometría de masas, configure la fuente a 230 grados Celsius, el cuadrupolo a 150 grados Celsius y el rango de masa de barrido a 50–650 AMU a 2,46 barridos por segundo. El retardo del disolvente es de 3,5 minutos. Las temperaturas del instrumento son de 200 grados Celsius para el inyector y de 250 grados Celsius.Para la interfase, ajuste el horno a 80 grados Celsius durante un minuto, luego aumente a cuatro grados Celsius por minuto desde 80 hasta 130 grados Celsius, después aumente a seis grados Celsius por minuto desde 130 hasta 200 grados Celsius, y finalmente aumente a 12 grados Celsius por minuto desde 200 hasta 285 grados Celsius y mantenga durante 10 minutos. Coloque los microviales que contienen las muestras derivadas de ojo para inyección automatizada por el GCMS e inicie el análisis. Se muestra aquí un espectro representativo de una muestra de orina analizada mediante GCMS tras el tratamiento con ureasa, con los picos correspondientes a los metabolitos ácido pirroglutámico, ácido 4-hidroxicicloacético y hawkinson marcados.Estos metabolitos son indicativos de la anuria de Hawkins, un trastorno genético raro. Todos los picos en el espectro pueden asignarse a metabolitos conocidos y cuantificarse. Los resultados de las pruebas iniciales de cribado neonatal pueden ser inespecíficos.Sin embargo, los niveles elevados de metabolitos de la UR de Hawkins en la muestra de orina analizada mediante GC-MS, como se muestra aquí, confirmaron el diagnóstico de esta enfermedad congénita del metabolismo. Utilizando el mismo método de URIs, se diagnosticaron errores congénitos en 184 pacientes. Casi el 40 % de los diagnósticos indicados en rojo no se habrían detectado mediante espectrometría de masas en tándem, comúnmente utilizada en el cribado neonatal.Así que esta es nuestra demostración de cómo realizar metabolómica de un solo paso utilizando el método de ureasa para analizar fluidos biológicos en busca de carbohidratos, ácidos orgánicos y aminoácidos, y acil glicina, todo en el mismo procedimiento. Es importante recordar que al evaluar la eficacia del procedimiento, la digestión con ureasa, la deshidratación y la simulación de trimetilación pueden evaluarse todas por su completitud. Simplemente verificando la presencia de todos los estándares internos.Los estándares internos se seleccionaron deliberadamente para demostrar, por ejemplo, que la deshidratación se completó por completo, ya que si no fuera así, la creatinina TRI TMS no estaría presente en su cantidad total. Esa es nuestra demostración. Si está interesado en las macros y bibliotecas que hemos desarrollado para interpretar este procedimiento utilizando ChemStation, envíeme un correo electrónico a la dirección que aparece en su pantalla, y podrá encontrar más información sobre nuestro laboratorio en la URL que aparece en su pantalla.Gracias mucho. Este es Jim Shoemaker.

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El propósito de este artículo es describir un protocolo para la extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para el análisis metabolómico, particularmente, electroforesis capilar-espectrometría de masas.

Extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para análisis metabolómicos por electroforesis capilar-espectrometría de masas

Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Se presenta un método para el análisis no focalizado de metabolitos y lípidos de grano de trigo. El protocolo incluye un método de extracción de metabolito de acetonitrilo y una metodología de espectrometría de masas de cromatografía líquida de fase inversa, con adquisición en modos de ionización de electrospray positivo según lo negativo y negativo.

Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo

Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.

Metabolómica cuantitativa de Saccharomyces cerevisiae mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem

Los protocolos describen métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento acoplados al índice de refracción o a la detección espectrométrica de masas para estudiar reacciones metabólicas en sistemas complejos libres de células basados en lisato.

Cromatografía líquida acoplada a la detección de índice de refracción o espectrometría de masas para perfiles de metabolitos en sistemas libres de células basados en lisato

Construimos un flujo de trabajo metabolómico no dirigido que integró XY-Meta y metaX juntos. En este protocolo, mostramos cómo usar XY-Meta para generar una biblioteca espectral señuelo a partir de la referencia de espectros de acceso abierto, y luego realizamos el control FDR y usamos el metaX para cuantificar los metabolitos después de identificar los espectros metabolómicos.

Un flujo de trabajo integrado de identificación y cuantificación en un metaboloma no dirigido basado en el control FDR

Este protocolo tiene como objetivo preservar los metabolitos celulares para la espectrometría de masas unicelular (SCMS) mediante la combinación de lavado con solución salina volátil, enfriamiento rápido de nitrógeno líquido, liofilización y almacenamiento a -8 °C. Demuestra que el enfriamiento con nitrógeno líquido es esencial para mantener los perfiles de metabolitos, mientras que el almacenamiento prolongado en frío debe minimizarse para evitar alteraciones metabólicas.

Preparación de muestras para espectrometría de masas unicelular Estudios metabolómicos: lavado, enfriamiento, secado y almacenamiento combinados de células

Aprende metabolómica en un solo paso para cuantificar carbohidratos, ácidos orgánicos y aminoácidos mediante GC/MS. Este método mejora el cribado neonatal detectando un 38% más de trastornos metabólicos hereditarios.

De un solo paso metabolómica: Hidratos de carbono, ácidos orgánicos y aminoácidos cuantificados en un procedimiento único

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