Vierweg Olfactometer-test: een methode om odorant-cued-reacties in Drosophila te beoordelen

- Een vierweg olfactometer is een gesloten kamer met eenrichtingspoorten op elke hoek, waardoor het tot vier geuren kan afgeven, waardoor kwadranten met verschillende geurprofielen ontstaan. Begin een experiment door wakkere vliegen in de kamer over te brengen. Vermijd anesthesie, omdat dit hun gedrag tijdens het experiment kan beïnvloeden.

Stel de vliegen bloot aan schone lucht en observeer hun bewegingen om ervoor te zorgen dat geen geurstoffen de olfactometer besmetten en het vlieggedrag beïnvloeden. Bereid vervolgens de testgeurstoffen voor in afzonderlijke flacons en verbind ze met de hoofdkamer via de eenrichtingspoorten. Stel de vliegen gedurende een vooraf gedefinieerde periode bloot aan de geurstoffen en verwijder de stimulus nadat de proef is beëindigd.

Vliegen hebben de neiging om kwadranten met afstotende geuren te vermijden terwijl ze zich verplaatsen naar en zich vestigen in kwadranten met aantrekkelijke geuren. Meet de geur-cued gedragsreacties van de vliegen door hun posities in de loop van de tijd te volgen terwijl ze de olfactometer verkennen.

In het volgende protocol gebruiken we een olfactometer met vier kwadranten met een luchtafgiftesysteem om vlieggedrag te analyseren als reactie op ethylpropionaat, een afstotende geurstof en appelciderazijn, wat aantrekkelijk is.

- Schakel ten minste vijf minuten van tevoren de temperatuurregelaar in en stel deze in op 25 graden Celsius. Sluit vervolgens de geurkamers aan op de arena via een plastic buis. Controleer de luchtstroomsnelheid in elk kwadrant van de arena met behulp van een elektronische stroommeter. Zorg ervoor dat de controle en geur- en luchtstroomstromen beide op 100 milliliter per minuut lopen.

- Vliegen zijn erg gevoelig voor luchtstroom en het is van cruciaal belang dat de luchtstroom voor elk kwadrant vóór elk experiment wordt geverifieerd.

- Reinig nu de arena en de glasplaten met 70% ethanol. Veeg alle onderdelen twee tot drie keer af en laat ze volledig aan de lucht drogen voordat u verder gaat. Klem vervolgens de glasplaten naar de arena. Breng vervolgens de vliegen zonder verdoving de arena in. Laat ze met behulp van de zwaartekracht door het gat in een van de glasplaten komen en bedek het gat vervolgens met een cirkelvormig gaas.

Plaats nu de met vliegen geladen arena in de lichtdichte kamer. Sluit vervolgens de vier regelluchtstromen aan op elke arenahoek. Sluit de deur van de kamer en laat de vliegen 10 tot 15 minuten wennen aan de nieuwe omgeving.

Voer na de acclimatisatieperiode een controle-experiment van 5 tot 10 minuten uit waarin vliegen worden blootgesteld aan vier controleluchtstromen. Het is essentieel om de gegevens nu onmiddellijk te analyseren. Als de vliegen niet gelijkmatig in de arena worden verdeeld, moet de arena worden gereset.

- Het is van cruciaal belang om het gedrag van controlevliegen te testen om alleen lucht schoon te maken. Dit zal snel controleren of alle achtergrondomstandigheden normaal zijn. Lekkend licht, temperatuuronbalans, gekanteld arena of een geurverontreiniging kunnen allemaal problemen veroorzaken.

- Gooi indien nodig de vliegen weg en maak de arena opnieuw schoon. Als een geurige verontreiniging wordt vermoed, vervangt u alle slangen. Herhaal de controletest met nieuwe cohorten totdat de dieren geen voorkeur hebben voor een van de vier kwadranten. Sluit vervolgens de geurkamer van de test aan op de opstelling met behulp van een driewegklep, of sluit de slang opnieuw aan en voer een testexperiment uit gedurende 5 tot 10 minuten. Voor langere experimentele opnamen stopt en herstart u het trackingprogramma snel om de 20 minuten.

Gooi tussen de tests de vliegen weg, reinig de arena en glazen platen met 70% ethanol en vervang de verbindingsbuizen. Houd de droge luchtstroom continu door het systeem. Voor efficiëntie is het goed om twee arena's te hebben, zodat het schoonmaken tijdens runs kan worden gedaan.

- Als er meerdere experimenten op dezelfde dag worden uitgevoerd, wees dan uiterst voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen geur in het systeem achterbleef van een eerdere run. Dit is normaal gesproken geen probleem met lage concentraties geurstof of met CO2. Maar voor sterk geconcentreerde stimuli kan een gat van 24 uur tussen experimenten nodig zijn.