0 visualizaciones • 5:51 min. • April 30th, 2023
- Recolectar embriones vivos de Drosophila y eliminar sus coriones no transparentes. Luego, sobre un cubreobjetos de vidrio, aplique una línea de pegamento de heptano, que es cinta adhesiva disuelta en heptano líquido. Para poder manipular los embriones ahora descorionados, alinee cuidadosamente las muestras en una fila con el adhesivo.
Transfiera el cubreobjetos a una cámara de deshidratación para desecar parcialmente los embriones. Esto evitará la fuga citoplasmática durante o después de las inyecciones. A continuación, retire el cubreobjetos y cubra los embriones con aceite de halocarbono para evitar una mayor deshidratación y permitir que el oxígeno se difunda en los embriones.
Para realizar la microinyección, utilice un sistema de microinyección en un microscopio compatible. Al mirar a través de las piezas oculares, identifique tanto los embriones como la aguja precargada con la solución inyectable. Abra la aguja y asegúrese de que produzca gotas líquidas consistentes y del tamaño adecuado. A continuación, introduzca la aguja en el interior del embrión e inyecte el volumen adecuado. Saque la aguja y proceda a la siguiente, repitiendo la inyección para los embriones restantes.
En el protocolo de ejemplo, veremos una demostración de la microinyección de embriones de Drosophila para estudios de imagen en vivo de la división celular.
- Antes de colocar el cubreobjetos, haz pegamento de heptano desenrollando cinta adhesiva doble y colocándola en una botella de 100 mililitros. Agregue unos 50 mililitros de heptano, selle la botella y muévala durante varios días.
Antes de preparar los embriones, haga una cámara de deshidratación en la que se colocarán los embriones antes de la inyección. Para hacer esto, coloque una parte de un plato de 35 milímetros dentro de un plato de Petri de 100 milímetros para hacer una "mesa". Agregue drierita, que es sulfato de calcio anhidro, a su alrededor para que la altura de la drierita no sea más alta que la "mesa" y cubra.
Para comenzar a preparar los embriones, primero recójalos de la jaula de puesta cambiando el plato de jugo de uva con levadura cada hora. Los embriones deben ser fotografiados aproximadamente dos horas después del inicio de la recolección. Para preparar el cubreobjetos, colócalo en un lado de un portaobjetos de microscopio y pega las cuatro esquinas con cinta adhesiva para que no se mueva.
Con un aplicador con punta de algodón, coloque una capa de pegamento de heptano en una línea sobre el cubreobjetos. El pegamento no debe ser viscoso y debe secarse en unos segundos. Si está demasiado espeso, agregue más heptano.
Por último, coloca un trozo de cinta adhesiva doble en el portaobjetos junto al cubreobjetos. Con un cepillo humedecido, recoja con cuidado los embriones del plato de jugo de uva y colóquelos en la cinta adhesiva doble en el portaobjetos.
A continuación, use la mitad de una pinza para enrollar los embriones sobre la cinta adhesiva doble hasta que el corion se abra. Levante el embrión haciéndolo rodar suavemente sobre el corion, de modo que se pegue a la pinza, y colóquelo sobre el pegamento de heptano en el cubreobjetos con el lado largo del embrión paralelo al lado largo del cubreobjetos.
Coloque de 10 a 20 embriones en una fila. Retire el cubreobjetos y colóquelo en la cámara de deshidratación durante tres a ocho minutos. El tiempo depende de la humedad local y de la cantidad a inyectar. A continuación, coloque el cubreobjetos en una cámara metálica con grasa para aspiradoras. Por último, cubre los embriones con aceite de halocarbono para evitar una mayor deshidratación. Los embriones ya están listos para la inyección.
Primero, encuentre los embriones bajo un objetivo 16X. Aleja los embriones y encuentra la aguja sin mover el plano focal. Centre la aguja y muévala hacia arriba sin moverla en la dirección X o Y.
Para abrir la aguja, coloque el borde del cubreobjetos en el campo de visión, pero no donde estará una aguja, y baje la aguja al mismo plano focal. Con mucho cuidado, mueva el cubreobjetos hasta que golpee la aguja y la abra suavemente. Mueve la aguja hacia arriba.
Ahora trae los embriones a la vista. Sumerge la aguja en el aceite y asegúrate de obtener buenas gotas de líquido de la aguja. Mueva constantemente el embrión en la aguja, inyecte una gota en el embrión y luego aleje el embrión. Una vez que todos los embriones han sido inyectados, están listos para ser observados en un microscopio confocal con un objetivo de 60 o 100X.