Ensayo de gradiente de temperatura: un método para probar la preferencia de temperatura en larvas de Drosophila

- Para probar la preferencia de temperatura de las larvas de Drosophila, cree un gradiente de temperatura calentando un lado de una placa de ensayo de aluminio y enfriando el otro. El aluminio tiene una alta conductividad térmica, lo que significa que el calor se transfiere de manera eficiente, creando un gradiente de temperatura lineal estable. Una vez que el sistema se haya equilibrado, registre las temperaturas en toda la placa en zonas de temperatura del mismo tamaño, luego cargue el centro de la placa con larvas limpias.

Cubra todo el sistema para eliminar la interferencia de la luz brillante e inicie la prueba. Las larvas se distribuyen a través del gradiente, evitando las zonas aversivas que son demasiado cálidas o demasiado frías, y se establecen en zonas de temperaturas favorables. Este comportamiento se denomina termotaxis. Para evaluar la preferencia de temperatura de las larvas, registre el número de animales en cada zona de temperatura.

En el protocolo de ejemplo, veremos cómo configurar un gradiente de temperatura unidireccional entre 18 y 28 grados centígrados, y cómo se manejan las larvas durante el ensayo.

- Para preparar un gradiente unidireccional, primero cree un ambiente húmedo para el ensayo. Coloque dos bloques de aluminio conectados a baños de agua separados sobre toallas de papel húmedas a 10 centímetros de distancia. Los baños de agua deben calentarse con anticipación. A continuación, prepare 100 mililitros de agarosa al 1% y agregue 25 mililitros a cada placa de ensayo sobre una superficie nivelada. Una vez que la agarosa se haya solidificado, frote suavemente la superficie con una esponja de melamina para que la superficie quede ligeramente áspera.

Luego, para promover una transferencia de temperatura eficiente, llene los espacios entre los bloques de aluminio en las placas de ensayo con agua suministrada de una botella rociadora. Ahora, coloque las placas de ensayo en los bloques de aluminio y asegúrese de que las demarcaciones estén a 2 centímetros de cada borde para que coincidan exactamente con los bordes de los bloques de aluminio.

A continuación, rocíe una película de agua sobre la superficie de las placas para que los geles no se sequen. A continuación, cubra el sistema con una caja de cartón para reducir la evaporación y ayudar a estabilizar la temperatura de la superficie del gel. Espere de 5 a 10 minutos para permitir que la temperatura se equilibre. Luego, verifique la temperatura de la superficie de la placa en al menos 12 ubicaciones para asegurarse de que haya una temperatura uniforme en todo momento, más o menos 2 grados centígrados. Luego, vuelva a colocar la tapa de la caja hasta que se realice el ensayo.

Primero, retire la caja de cartón sobre el gel y verifique rápidamente la temperatura de la superficie del gel. Si la superficie está seca, rocíe una pequeña cantidad de agua sobre la superficie. Si el gel es bueno, cargue de 100 a 200 larvas en el centro de cada plato con un pincel pequeño. Luego, coloque una tapa sobre cada placa de ensayo para atrapar las larvas y cubra la instalación con una caja de cartón para evitar la exposición a la luz. El ensayo está ahora en curso.

Después de 10 a 30 minutos, retire la caja de cartón y la tapa de la microplaca. Luego, fotografíe las placas desde arriba para registrar la posición de las larvas. Coloque la caja encima de la cámara para evitar reflejos en la superficie del gel. Para limpiar el plato, aspire todas las larvas donde sea que se hayan dispersado.

Ahora, calcule la distribución porcentual de las larvas en cada zona utilizando un software de análisis de imágenes. Haga líneas cada 2 centímetros en función de las demarcaciones en la placa de ensayo y cuente el número de larvas en cada zona.

- Al contar, ignore las larvas distribuidas en regiones a 0,5 centímetros de cada borde. El espesor del gel y las condiciones de temperatura no son uniformes cerca del borde.