0 visualizaciones • 5:52 min. • April 30th, 2023
- A diferencia de los vertebrados, el corazón de Drosophila forma parte de un sistema circulatorio abierto. El corazón de una mosca adulta es una estructura en forma de tubo construida a partir de cardiomiocitos que está conectada a la epidermis por músculos alares e incrustada en la matriz extracelular. La cámara cardíaca se encuentra en el extremo posterior de la mosca y bombea hemolinfa a la aorta, desde donde fluye hacia la cavidad corporal abierta.
En los insectos, la hemolinfa sirve como sangre y líquido intersticial, transportando nutrientes, moléculas de señalización y células inmunitarias. Otros puntos de referencia del corazón son los ostia, que son aberturas a lo largo del tubo, y las válvulas intracardíacas. Las células pericárdicas se localizan a lo largo del tubo cardíaco y forman parte del sistema excretor de la mosca.
En una preparación cardíaca experimental, la hemolinfa artificial imita las condiciones fisiológicas para preservar la función de los tejidos. Aunque la hemolinfa natural no es responsable del intercambio de gases, la hemolinfa artificial debe estar bien oxigenada para sustituir la falta de un sistema traqueal funcional. En el siguiente experimento, demostramos una preparación de corazón semi-intacto de una mosca adulta para imágenes en vivo o electrofisiología.
- Antes de comenzar, primero preparamos una solución de hemolinfa artificial. Esta solución contiene sacarosa y trehalosa, que deben añadirse a la hemolinfa artificial a partir de soluciones madre refrigeradas justo antes de su uso para evitar la contaminación bacteriana. Lleve la hemolinfa artificial a temperatura ambiente y oxigene la solución mediante burbujeo de aire durante al menos 15 minutos.
A continuación, extraiga varios capilares finos con un extractor de pipeta estándar, que será necesario para la eliminación de los cuerpos de grasa de la mosca.
Una vez que todo se ha preparado, las moscas adultas deben ser anestesiadas. Esto se puede hacer usando una breve exposición a la siesta de mosca de dos a cinco minutos, pero tenga cuidado de no dejar a las moscas en la siesta más de cinco minutos. La exposición a corto plazo al frío también se puede utilizar para anestesiar a las moscas, pero no se recomienda el dióxido de carbono ya que tiene efectos más duraderos sobre la frecuencia cardíaca y la ritmicidad.
A continuación, las moscas anestesiadas se colocan, con la dorsal hacia abajo, en una placa de Petri recubierta con una fina capa de vaselina. La cutícula hidrofóbica de las alas y el cuerpo debe adherirse de forma reversible a la gelatina, pero la mosca se puede reposicionar si es necesario. Se realiza un corte inicial con un par de tijeras de resorte curvas. Esto se hace colocando las hojas de tijera debajo de las patas de la mosca y en ángulo hacia la superficie dorsal del tórax cerca del cuello.
La cabeza, el cordón nervioso ventral y las patas se extraen con un solo corte. Una vez cortado, el preparado se sumerge en la solución de hemolinfa artificial oxigenada. Con unas tijeras de resorte, se extrae la punta posterior del abdomen, que está compuesta por los segmentos abdominales 7 y 8, con un solo corte. Esto proporciona acceso para hacer cortes laterales a lo largo de ambos bordes del abdomen y sirve para cortar la conexión entre el intestino posterior y la cutícula abdominal.
Inserta las hojas de las tijeras en la pequeña abertura en la punta del abdomen y corta la cutícula lateralmente. Esto libera un borde de la cutícula ventral. Agarre el colgajo con pinzas y haga una incisión similar a lo largo del borde lateral opuesto del abdomen. Ahora se puede quitar el colgajo liberado de la cutícula abdominal ventral.
El intestino y otros órganos abdominales generalmente se pueden extirpar como una sola masa usando fórceps de joyero y tirones suaves. La extirpación de los órganos internos revela el tubo cardíaco latente, que todavía está unido a la cutícula dorsal por pequeños músculos alares y está rodeado de cuerpos grasos. Los capilares extraídos se insertan en un tubo de plástico de 1/16 de pulgada conectado a una fuente de vacío. La fuerza de succión es proporcional al diámetro de la punta, por lo que no se deben utilizar pipetas con puntas de más de 40 micras de diámetro.
Una vez configurado, este sistema de succión se utiliza para succionar el exceso de grasa alrededor del tubo cardíaco. También se puede utilizar para eliminar las burbujas de aire que se acumulan alrededor de la cutícula y cualquier residuo. Se debe tener mucho cuidado para evitar tocar el corazón mismo, y debido a que la porción posterior del corazón es muy frágil, esa región debe evitarse por completo. El tubo cardíaco de Drosophila adulto ahora está expuesto y debería estar latiendo.
Si es necesario, la cutícula y el corazón adherido se pueden reposicionar levantando suavemente la cutícula de la vaselina y apisonándola con cuidado, evitando nuevamente cualquier contacto con el tejido cardíaco. En este punto, la solución que baña la preparación debe reemplazarse con hemolinfa artificial fresca. Esta preparación debe dejarse equilibrar durante 20 a 30 minutos con oxigenación antes de cualquier manipulación. Si la preparación se va a mantener durante más de 60 minutos, se debe volver a perfundir con hemolinfa artificial fresca. Esta preparación ya está lista para ser utilizada para el registro óptico y también se puede utilizar para el registro electrofisiológico o para manipulaciones histológicas.