0 visualizaciones • 3:10 min. • April 30th, 2023
- Comience con huevos peletizados que se aislaron mediante el blanqueo de gusanos adultos grávidos. Asegúrese de que cada paso de este procedimiento se lleve a cabo de manera estéril para evitar la contaminación de las células cultivadas. Suspenda el pellet en una solución de quitinasa, una enzima que descompone la quitina, un polisacárido grande que es un componente estructural de la cáscara del huevo.
Después de un período de digestión adecuado, centrifugue suavemente los huevos y reemplace el sobrenadante con medio de cultivo celular para detener la digestión. Luego, pasa los embriones a través de una aguja de calibre 18 para separar mecánicamente las células individuales. A continuación, filtre la solución para eliminar los restos de la cáscara del huevo o los grupos de células no separadas. Coloque las células en una placa de cultivo en un cubreobjetos de vidrio recubierto con aglutinina de maní, una lectina que ayuda a las células a adherirse al cubreobjetos al unir los carbohidratos de la superficie celular.
En el protocolo de ejemplo, prepararemos células embrionarias para la diferenciación morfológica y el análisis in vitro.
- Mientras trabaja bajo una campana de flujo laminar para evitar la introducción de contaminación bacteriana, vuelva a suspender los huevos peletizados en un mililitro de dos miligramos por mililitro de quitinasa y transfiéralos a un tubo cónico fresco de 15 mililitros. Agite el tubo durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente, dependiendo de la frescura de la enzima. Cuando se haya digerido aproximadamente el 80% de las cáscaras de huevo, centrifugar los huevos a 900 g durante tres minutos.
Después de retirar con cuidado el sobrenadante, agregue tres mililitros de medio L15. Transfiera los huevos a una placa de seis centímetros de diámetro y comience la disociación manual con una jeringa estéril de 10 mililitros con una aguja de calibre 18. Para controlar el grado de disociación, coloque una gota de suspensión en una placa de Petri nueva y obsérvela bajo un microscopio. Continúe hasta que aproximadamente el 80% de las células estén disociadas.
Para eliminar los grupos de células, los huevos no digeridos y las larvas eclosionadas, filtre suavemente la suspensión a través de un filtro de cinco micras y pase de cuatro a cinco mililitros adicionales de medio L15 a través del filtro para recuperar las células. Para cultivar las células después de centrifugar el filtrado a 900 g durante tres minutos, vuelva a suspender las células en medio L15 completo. Coloque un mililitro por pocillo y guarde las placas en una cámara húmeda y sellada a 20 grados centígrados en el aire ambiente.