C. elegans Ensayo de quimiotaxis: un método para probar la quimiosensación en gusanos

- Para dar sentido a las condiciones encontradas y responder a ellas en consecuencia, el gusano C. elegans tiene, entre otros, un sistema quimiosensorial altamente desarrollado capaz de detectar una amplia variedad de productos químicos diferentes.

Las neuronas sensoriales de la cabeza, las neuronas anfiformes y labiales internas, así como las neuronas de la cola, las neuronas fásmidas, están expuestas directa o indirectamente a través de la cutícula a las condiciones externas. Estas neuronas quimiosensoriales codifican información relevante utilizada por el gusano para producir una respuesta conductual adecuada: un comportamiento denominado quimiotaxis.

Para probar la respuesta quimiotáctica a los odorantes volátiles o a las señales gustativas solubles en agua, aísle los gusanos de la etapa de desarrollo deseada y expóngalos al producto problema en un campo experimental previamente preparado. Cuando se expone a sustancias químicas favorables como las producidas por una fuente de alimento bacteriana, C. elegans muestra una quimiotaxis positiva hacia la fuente.

Por el contrario, cuando se expone a productos químicos menos favorables o tóxicos como los metales pesados, el gusano muestra una quimiotaxis negativa, evitando el producto químico. Por lo tanto, los mutantes olfativos o gustativos no logran evitar los productos químicos aversivos y permanecen en condiciones desfavorables en contraste con los animales de tipo salvaje que evitan la condición aversiva.

En el protocolo de ejemplo, veremos una demostración de un ensayo de quimiotaxis, probando la aversión del gusano al cobre.

- Después de la incubación durante la noche, retire las placas de la incubadora y, utilizando la parte inferior marcada de la placa como guía, pipetee 100 microlitros de solución de dos sulfatos de cobre 0,5 molar recién preparada en el borde del agar para crear una barrera de cobre exterior. Pipetee 25 microlitros de la solución de cobre y dos sulfatos para crear una barrera en la línea media.

Asegúrese de que la solución de dos sulfatos de cobre no entre en contacto con el parche bacteriano y permita que la solución de cobre se seque en la placa. Verifique la sequedad cada cinco minutos después de la transferencia con un pañuelo de laboratorio frotando ligeramente la solución cerca del borde de la placa para discernir.

Inmediatamente antes del ensayo, transfiera los organismos experimentales a una placa de agar libre de bacterias y permita que los nematodos se muevan libremente durante un minuto para eliminar el exceso de bacterias.

A continuación, pipetee 1 mililitro de M9 en la placa con adultos jóvenes que se transfirieron 24 horas antes para lavar los gusanos en un tubo de microcentrífuga. Centrifugar los nematodos a 3.000 veces g durante un minuto.

Los gusanos deben formar una bolita en el fondo del tubo. Aspire la solución M9 sin alterar el gránulo de gusano. Agregue 1 mililitro de solución M9 a la bolita de gusano. Invierta el tubo para mezclar los gusanos con la solución.

Si el exceso de bacterias se transfirió inicialmente con los gusanos, repita el procedimiento un total de cinco veces. Después del lavado final, aspire el sobrenadante hasta que queden 100 microlitros de solución M9 y el pellet de gusano. Transfiera inmediatamente los gusanos de la solución una vez que se hayan completado los pasos de lavado.

Pipetee 20 microlitros del gránulo de gusano desde el fondo del tubo en la mitad libre de bacterias de la placa de ensayo. Asegúrese de que se transfieran 10 lombrices a la placa de ensayo y de que no haya alimentos contaminantes. No se deben transferir bacterias a las placas de cobre de la raza alimentaria.

Elimine el exceso de solución M9 de los nematodos con un tejido de laboratorio en un minuto. Asegúrese de que la solución M9 no entre en contacto con la solución de dos sulfatos de cobre y que la superficie de los gusanos y el agar permanezcan intactos. Deseche los gusanos que se hayan eliminado accidentalmente con el tejido de laboratorio.

Una vez que se haya retirado la solución M9 y todos los gusanos hayan comenzado los patrones locomotores no líquidos, es decir, cuando hayan dejado de agitarse, inicie el cronómetro de ensayo. Si accidentalmente se incluyeron gusanos adicionales, elimínelos hurgando con aceite de halocarbono para asegurarse de que no se agreguen bacterias al plato.

Revise las placas de ensayo cada 30 minutos. En el caso de las placas de ensayo con parches bacterianos, puntúe positivamente los organismos si llegaron al parche de alimentos durante un período de cuatro horas. En el caso de las placas de control negativas, puntúe positivamente los organismos si han cruzado la barrera.