C. elegans Seguimiento del movimiento: un método para evaluar la locomoción en gusanos

- Para evaluar la locomoción en C. elegans, use una cámara para registrar el movimiento de los gusanos en una placa de agar, asegurando una iluminación uniforme de la placa durante el registro. Para restringir el movimiento de los gusanos alrededor de la placa, use anillos de cobre. El cobre es aversivo a C. elegans, por lo que los gusanos se acorralan dentro de los anillos.

Coloque varios anillos de cobre en una placa para rastrear simultáneamente los gusanos en cada anillo. Esto permite que la evaluación de los animales de control y de experimentación se realice en condiciones idénticas, lo que reduce la variabilidad diaria y permite realizar comparaciones lado a lado. Registre el movimiento de los gusanos en intervalos de tiempo establecidos y use software de computadora para analizar las características del comportamiento de la locomotora, como la velocidad de movimiento y la distancia recorrida.

En el protocolo de ejemplo, veremos una demostración de un ensayo de seguimiento del movimiento que prueba los efectos del alcohol en la velocidad de locomoción del gusano.

- Para comenzar, tómese dos minutos o menos para transferir 10 gusanos de cada grupo experimental al centro de un anillo de cobre en una placa de aclimatación. Se trata de una placa sin etanol. Evite transferir comida con los gusanos, ya que reducirá su movimiento. También evite dañar la superficie del agar porque los gusanos se enterrarán. Registre el tiempo de carga en la placa y asegúrese de escalonar la transferencia de gusanos a cada placa en más de dos minutos, de modo que cada placa se pueda filmar individualmente en el intervalo de tiempo apropiado.

Deje que cada placa de aclimatación se incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, transfiera los gusanos a la placa de ensayo, siguiendo el orden utilizado para colocar los gusanos en la placa de aclimatación. Usando un pico de gusano aplanado de borde delgado sin bacterias, recoja los gusanos encima del pico aplanado con un movimiento de cuchara. Luego, selle la placa con una película de laboratorio para minimizar la pérdida de etanol por vaporización.

- La velocidad a la que se transfieren los animales en esta etapa es muy importante, ya que los animales transferidos estarán expuestos al etanol durante más tiempo. Por lo tanto, es una buena idea rotar las cepas que se colocan primero en la placa a través de las réplicas experimentales.

- Ahora se requiere un microscopio con una cámara de video de alta resolución para filmar a los gusanos. Incluso la iluminación, como la de una luz de fondo cuadrada de tres pulgadas, es vital para el análisis. A continuación, para mantener el contraste, cree una imagen de la placa con el lado del papel hacia arriba.

Prepare el software de análisis de imágenes para capturar vídeos de 120 fotogramas, 12 bits, escala de grises y time-lapse en un fotograma por segundo. Para reducir el tamaño del archivo de salida, sin dejar de conservar una resolución de imagen suficiente, utilice un modo de agrupación de dos por dos.

Ahora grabe películas de dos minutos de cada plato, 10 minutos después de que se colocaron los últimos gusanos en ese plato. Luego haga una segunda grabación de dos minutos, 30 minutos después de que se colocaron los gusanos en el plato. Para esta demostración se utiliza el software Image-Pro Plus, ya que se puede adaptar una amplia variedad de otros programas a la técnica. Analice las películas como segmentos de dos minutos.

Primero aplique un filtro a las imágenes que aplana el fondo y mejora el contraste de los objetos de gusano. En el menú, seleccione Proceso, Filtros, Mejora y, a continuación, Acoplar. Establezca el parámetro para un fondo oscuro y un ancho de función de 20 Pix.

Ahora, analice la locomoción de los animales en cada anillo por separado con una región circular de interés que se superpone al anillo de cobre. Identifique y rastree los gusanos con el comando Rastrear objetos en el submenú Medir.

En la ventana Tabla de datos de seguimiento, utilice el botón Opciones de seguimiento para permitir que se excluyan pistas específicas y limitar los artefactos experimentales. En la pestaña Seguimiento automático, establezca los parámetros de la pista en un límite de velocidad de 400 micras por fotograma. Establezca el límite de aceleración en Automático.

Establezca la Longitud total mínima de la pista en 400 micras y establezca el Tipo de movimiento predominante en Caótico. A continuación, en el parámetro de seguimiento, defina los objetos para permitir que las pistas parciales tengan una longitud mínima de 21 fotogramas y una profundidad de proyección de seguimiento de un fotograma.

Ahora, para iniciar el proceso de seguimiento, primero haga clic en el botón de la función Buscar todas las pistas automáticamente. Aparecerá el cuadro de diálogo Opciones de recuento/tamaño y el cuadro de diálogo Seguimiento. Seleccione la opción Manual para la Selección del rango de intensidad en el cuadro de diálogo Recuento/Tamaño. Esto proporciona un paso de umbral importante. A continuación, ajusta los reguladores "Umbral de intensidad" para crear un rango inclusivo que resalte los objetos oscuros. Un buen punto de partida en la escala es entre 0 y 1.500.

Ahora aplique un filtro de tamaño para excluir objetos que sean más grandes o más pequeños que un solo gusano. Vaya al menú Medida y, a continuación, seleccione el submenú Medición. Se abrirá el cuadro de diálogo Opciones de recuento/tamaño. Allí, establezca el rango de área de 28,000 a 120,000 micras cuadradas. Y establezca el rango perimetral de 600 a 2.500 micras. Realice ajustes en estos parámetros cuando utilice gusanos de tamaño anormal.

Ahora, complete el proceso de seguimiento haciendo clic en Continuar en el cuadro de diálogo de seguimiento. Vuelva a comprobar que la salida se rastrea con el metraje de la película. Asegúrese de que todos los gusanos estén representados a menos que haya una razón clara para filtrarlos. A continuación, elimine manualmente las pistas producidas por objetos que no sean gusanos.

A continuación, calcule la velocidad de cada gusano promediando la distancia recorrida entre cada fotograma o cada segundo, y cree una velocidad media para las pistas de cada población. Considere este promedio final como un punto de muestra para el análisis estadístico del experimento.