0 visualizaciones • 2:23 min. • April 30th, 2023
- Coloque un gusano transgénico que exprese GCaMP, una proteína sensible al calcio, en una cámara de imágenes junto con alimento bacteriano para el gusano. A continuación, selle el plato con la tapa y la película de laboratorio para evitar la evaporación. Véalo bajo un microscopio compuesto equipado para epifluorescencia de campo amplio. Grabe imágenes de lapso de tiempo de los gusanos para rastrear su comportamiento y capturar la fluorescencia mediante software de imágenes.
Los gusanos transgénicos expresan una proteína sensora GCaMP bajo el control de un promotor que impulsa la expresión de GCaMP en una neurona específica. Cuando esa neurona se activa, dispara un potencial de acción, que despolariza la membrana plasmática. Tras la despolarización, los canales de calcio dependientes de voltaje se abren en la membrana plasmática. Esto provoca una afluencia de iones de calcio en la célula, lo que resulta en la excitación neuronal.
GCaMP en la neurona excitada se une a los iones de calcio. Esto hace que GCaMP emita fluorescencia cuando los gusanos se visualizan con una luz de excitación de fluorescencia de baja intensidad. En el protocolo de ejemplo, utilizaremos imágenes de calcio para visualizar la actividad de las interneuronas AVA en C. elegans transgénicos en microcámaras de agarosa.
- Las imágenes de calcio se realizan en un microscopio compuesto equipado para epifluorescencia de campo amplio. Para limitar la exposición a la luz, utilice una señal lógica de transistor-transistor que active un LED para iluminar la muestra al mismo tiempo que la cámara graba un fotograma.
Ejecute una película de ráfaga durante 24 horas que muestre imágenes de cada gusano cada 15 a 30 minutos. Primero, registre 20 segundos con DIC, luego 20 segundos con fluorescencia GFP y, finalmente, una imagen de la señal mKate2 para controlar los niveles de expresión.
Para la inspección visual de datos, utilice un mapa de colores falsos para mejorar la visibilidad de pequeños cambios en la intensidad de la fluorescencia. Por último, realice el análisis de datos de calcio utilizando procedimientos estándar.