0 visualizaciones • 3:21 min. • April 30th, 2023
- Para comenzar, transfiera los gusanos adultos jóvenes a una almohadilla de agarosa fresca en un portaobjetos. A continuación, añade unas gotas de solución de levamisol de 12 milimolares para paralizar los gusanos. Cubra las lombrices con un cubreobjetos y espere unos minutos. Coloque el portaobjetos debajo de un microscopio confocal de disco giratorio y concéntrese en la superficie lateral más externa del gusano.
La epidermis de un gusano adulto es una estructura delgada de una sola capa que consta de sincitios multinucleados que resultan de eventos de fusión celular. La superficie apical de la epidermis segrega una cutícula de colágeno flexible, mientras que la superficie basal está cubierta por una fina capa de matriz extracelular llamada lámina basal.
A continuación, enrolle la superficie apical de la epidermis con un láser. El citoplasma de las células dañadas puede filtrarse, apareciendo como una burbuja en el sitio de la herida.
La irradiación láser tiene una ventaja sobre otras técnicas, como el herido con aguja, ya que provoca una disrupción localizada de la cutícula y las células epidérmicas, sin dañar los tejidos internos. En el protocolo de ejemplo, veremos el proceso de herida por láser en C. elegans.
- Para enrollar con precisión los nematodos, este protocolo utiliza un láser de femtosegundo conectado a un microscopio confocal de disco giratorio. Los escaneos lineales o puntuales con láseres de femtosegundos, como los de los microscopios de dos fotones, también deberían ser suficientes.
- Comience reuniendo a 10 adultos jóvenes en una almohadilla de agar. Paralizarlos en una gota de dos microlitros de solución de levamisol de 12 milimolares. A continuación, cúbrelos con un cubreobjetos y espera unos minutos mientras se paralizan.
- Es fundamental que un animal esté completamente paralizado. 12 milimolares de levamisol no afectará la respuesta de la herida. Sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos de inmovilización.
- Asegúrese de que la potencia del láser de femtosegundos esté configurada en 140 milivatios, medida antes del objetivo, y que la tasa de repetición del láser sea de 80 megahercios. Ahora, localice los gusanos bajo un microscopio confocal de disco giratorio. Usando un objetivo de 100x con una apertura numérica alta, concéntrese en la epidermis sincitial lateral anterior o posterior del gusano objetivo.
Enfocándose en la superficie apical de la célula epidérmica, haga brillar el láser durante dos pulsos de 200 milisegundos separados por 20 milisegundos. Esto debería ser suficiente para herir la epidermis. Espere un momento y observe la interrupción local del citoplasma, que aparecerá como burbujeo. Si hay un marcador fluorescente, se puede observar un blanqueamiento localizado.