0 visualizaciones • 3:59 min. • April 30th, 2023
- Para prepararse para la inyección, use un palillo de gusano para colocar un rastro de aceite de halocarbono en una almohadilla de agarosa. Coloque gusanos en el aceite e inmovilícelos empujándolos suavemente sobre la almohadilla de agar. Asegúrese de que el aceite cubra completamente a los animales. Permite que el oxígeno llegue a los gusanos mientras evita la desecación. A continuación, coloque la almohadilla de agarosa en un microscopio de inyección y coloque la aguja perpendicular al gusano, apuntando al extremo distal de un brazo gonadal.
Empuje suavemente la aguja a través de la cutícula e inyecte el brazo de la gónada con el ácido nucleico o compuesto de interés. Cada brazo gonadal contiene un sincitio de la línea germinal que se desarrollará en ovocitos individuales. El material inyectado en la gónada distal se incorporará a esos ovocitos y afectará a la siguiente generación.
Después de inyectar gusanos, reemplace el aceite con tampón M9. Una vez que los gusanos comiencen a moverse, transfiéralos a una placa de agar NGM con alimento bacteriano. En el siguiente protocolo, se utiliza el método de microinyección de gónadas para administrar un complejo Cas9 para atacar y editar el gen dpy-10.
- Comience con la preparación de las almohadillas de C. elegans y agarosa como se describe en el protocolo de texto. Coloque una almohadilla de inyección de agarosa y cubra el portaobjetos en un endoscopio de disección. Use un palillo de tornillo sin fin para colocar una pequeña pista de aceite de halocarbono a lo largo de un borde de la almohadilla. Luego, use el palillo de gusano recubierto de aceite para levantar varios gusanos de la placa de agar NG y colocarlos en la pista de aceite. Con un pelo fino unido a una pipeta, como una pestaña o un bigote de gato, coloque los gusanos en paralelo empujándolos suavemente hacia la almohadilla de agarosa. Hasta que se sienta cómodo con el procedimiento de microinyección, solo monte e inyecte un gusano a la vez.
Una vez en posición y unido a la almohadilla, superponga los gusanos con otras gotas de aceite de halocarbono de la punta del pico de gusano. Coloque el cubreobjetos con los gusanos montados en el microscopio de inyección. Bajo un aumento bajo, coloque los gusanos perpendiculares a la aguja de inyección, que se ha llenado con la solución RNP, como se describe en el protocolo de texto.
Cambie a un aumento alto y vuelva a colocar la aguja adyacente al brazo de la gónada, correspondiente a la región cercana a los núcleos en paquiteno medio a tardío. Con el micromanipulador, mueva la aguja contra el gusano, presionando ligeramente la cutícula. Luego, con una mano, golpee el costado de la platina del microscopio para sacudir la aguja a través de la cutícula. Presione el pedal o el botón de inyección, llene lentamente el brazo de la gónada con la mezcla de inyección y retire la aguja. Repite el paso con el otro brazo de la gónada.
Una vez que se inyectan los gusanos, retire el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa y colóquelo bajo un microscopio de disección. Con una pipeta capilar estirada, desplace el aceite de los gusanos pipeteando un tampón M9 sobre ellos. Realiza este tratamiento para liberar los gusanos del agar. Después de 10 minutos, cuando los gusanos estén revolcándose en el tampón, muévalos a una placa de agar NG con bacterias OP50 usando la pipeta capilar extraída. Coloque el plato a 20 grados centígrados durante dos o tres horas hasta que los gusanos se hayan recuperado y se muevan. Una vez recuperados, transfiera individualmente los gusanos a placas de agar NG con OP50 Luego, transfiera las placas a una incubadora a 25 grados centígrados.