0 visualizaciones • 3:40 min. • April 30th, 2023
- La creación de matrices de ADN extracromosómico por microinyección, el método más sencillo para generar cepas de gusanos transgénicos, da como resultado elementos genéticos que no se transmiten de manera estable durante la división celular y, por lo tanto, exhiben tasas de herencia y niveles de expresión variables. El objetivo de integrar la matriz en un cromosoma es disminuir esta inestabilidad y variabilidad genética.
Para ello, hay que empezar con una población de gusanos transgénicos L4 sincronizados por edad, que portan una matriz extracromosómica previamente introducida por microinyección y les permite convertirse en adultos grávidos. Transfiera a estos adultos a platos nuevos y permítales poner huevos hasta que haya al menos 30 huevos en cada plato. Retire los adultos y deje que los huevos crezcan hasta que alcancen la etapa L4. Luego, irradia los gusanos con luz ultravioleta. Esto provoca roturas aleatorias de doble cadena en el ADN genómico donde la maquinaria de reparación del ADN de los gusanos puede incorporar arbitrariamente la matriz.
Después de un período de recuperación de toda la noche, cuente el número de gusanos supervivientes. Un pequeño porcentaje de gusanos muertos indica una irradiación eficiente. Observar las generaciones subsiguientes para aislar líneas transgénicas homocigóticas integradas. En el protocolo de ejemplo, integraremos una matriz extracromosómica de alta tasa de transmisión que lleva un marcador fluorescente de coinyección expresado en la faringe.
- Evaluar la tasa de transmisión de la línea transgénica a integrar. Para cada línea transgénica, elija 10 adultos grávidos fluorescentes en 10 placas de cultivo separadas bajo un estereoscopio fluorescente. Cultivar los animales en una incubadora de lombrices a una temperatura permisiva para la reproducción del fondo genético.
Monitoree la progenie todos los días para evaluar en qué etapa de desarrollo se expresa el marcador de coinyección y se puede observar mejor. Usando estereoscopia fluorescente, evalúe la tasa de transmisión de la progenie determinando el porcentaje de progenie fluorescente. Para la integración del transgén, seleccione la línea transgénica con la tasa de transmisión más alta.
Obtener una población de animales transgénicos sincronizados en la etapa larvaria L4 para su integración. Escoja 30 adultos grávidos fluorescentes en cinco placas de cultivo. Después de que los gusanos hayan puesto huevos durante tres o cuatro horas a 15 grados centígrados, verifique la presencia de al menos 30 huevos en plato y luego, elimine a los adultos de los platos.
Cultive los animales en una incubadora de lombrices hasta que la progenie alcance la etapa larvaria L4. Coloque cada placa que contenga de 15 a 20 animales L4 transgénicos fluorescentes en un reticulante UV sin las tapas. Irradia los gusanos.
Para la recuperación, incube los gusanos irradiados durante la noche a 15 grados centígrados. Comprueba el número de animales que están vivos. En nuestras manos, una tasa de supervivencia de alrededor del 80% al 90% es adaptable para una irradiación eficiente. Cultive los animales irradiados a una temperatura de 15 a 25 grados centígrados hasta que la progenie haya alcanzado la etapa de desarrollo, lo que permite observar la expresión del marcador de co-inyección.