Name: Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-20T17:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a preparar tejido cerebral de ratón para inmunomicroscopía electrónica mediante perfusión transcardiaca, seccionamiento y tinción inmunoperoxidasa. Este protocolo permite visualizar la distribución de proteínas con alta resolución espacial.

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Damos las gracias a Shao-Ming Lu y A. Harris Gelbard para el uso de una bomba peristáltica y vibratome, así como Karen L. Bentley y Schneider Gayle en el Fondo para el núcleo Microscopio Electrónico de Investigación de la Universidad de Rochester Medical Center para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH (EY019277), la Fundación de Whitehall, Burroughs Wellcome Fund, y la Fundación Alfred P. Sloan de AKM. M.-È.T. es financiado por una Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Premio formación postdoctoral.

1. Los animales fueron perfundidos <ol><li> El día antes de la perfusión, preparar: - 2 L de tampón fosfato (PB; 100 mM, pH 7,4) y 1 l de sodio fosfato (PBS, 0,9% de NaCl en 50 mM PB, pH 7,4) con agua destilada. Guarde el PBS y 1 litro de PB a 4 ° C. Estos serán utilizados para la perfusión y la inmunocitoquímica pre-inclusión. - 1 litro de 4,0% de paraformaldehído (PFA, pH 7,4), la solución de fijación, que permitirá a la perfusión de 6 ratones. A tal efecto, calentar 1 L de PB en una campana extractora. Pesar 40 g de paraformaldehído granular (PFA) y se vierte en la solución de PB cuando llega a 60 ° C. Cuando la solución es clara, con la PFA completamente disuelta, enfriar a temperatura ambiente (TA) y se almacenan a 4 ° C. </li><li> En el día de la perfusión, preparar 500 ml de solución de acroleína 3,5% en PB bajo una campana extractora. A continuación, filtrar el 3,5% y 4,0% acroleína soluciones PFA con papel de filtro. </li><li> Para la anestesia del ratón, se inyectan pentobarbital sódico (80 mg / kg) en el peritoneo con una calibre 27 ½ "de la aguja. </li><li> Durante la perfusión, 50 ml de PBS, 75 ml de acroleína, y 150 ml de PFA secuencialmente pasar a la circulación del ratón. Para configurar la bomba peristáltica, llenar el tubo con PBS y fijar un calibre 23 ¾ "aguja de mariposa en un extremo. Sumerja el otro extremo de la tubería en la solución de perfusión (PBS, acroleína o PFA). Ajuste la velocidad de la peristáltica bomba a 20-25 ml / min para los ratones jóvenes y adultos. A lo largo de la perfusión, con cuidado de evitar cualquier burbujas de aire que se forman en el tubo. </li><li> Espere hasta que el ratón anestesiado ya no responde a los estímulos dolorosos, como una pizca de cola, antes de proceder. Coloque el animal en una bandeja de disección y fijar las patas con cinta adhesiva. Con pinzas y tijeras, abrir la piel y la cavidad torácica para exponer el corazón. Para minimizar la isquemia cerebral, la perfusión debe iniciarse rápidamente. Abrir la aurícula derecha con unas tijeras pequeñas y arrancar la bomba peristáltica. Mientras sostiene el corazón con unas pinzas, insertar la aguja de mariposa en el ápex del ventrículo izquierdo. </li><li> Cuando se cambia la solución, detenga la bomba peristáltica, la transferencia de los tubos de una solución a otra, y reiniciar inmediatamente la bomba. </li><li> Cuando 150 ml de PFA, pare la bomba peristáltica. Con la tijera pequeña, corte la cabeza, abrir la piel, y romper el cráneo entre los ojos. Con unas pinzas pequeñas, con cuidado de chips pequeños pedazos del cráneo hasta el cerebro se puede quitar fácilmente. Después de fijar el cerebro durante 2 horas a 4 ° C en PFA. Lavar 3 veces 10 minutos en PBS. </li><li> Inmediatamente corte transversal en el cerebro (50 secciones micras de espesor) en PBS enfriado con hielo usando un vibratome. Con un pincel fino, la transferencia de las secciones seleccionadas para inmunocitoquímica en un frasco de vidrio que contiene PBS. Guarde el resto de las secciones a -20 ° C en el crioprotector (30% glicol de etileno y 30% de glicerol en PBS) durante un máximo de varios años. </li></ol> 2. Pre-incrustación inmunocitoquímica <ol><li> Por inmunocitoquímica, se elaboran secciones de flotación libre en frascos de vidrio. A lo largo del procedimiento, hay que evitar con cuidado dejando que las secciones se sequen. </li><li> En primer lugar, eliminar el PBS utilizando una pipeta de transferencia y de inmediato sustituirlo por una nueva solución de borohidruro de sodio al 0,1% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aclarar las secciones con PBS 3 veces 10 minutos, eliminando todas las burbujas, y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución de bloqueo de PBS que contenía 0,5% de gelatina y 5% de suero normal de los animales en los que el anticuerpo secundario se ha generado (suero normal de cabra en el ejemplo actual de Iba1-tinción). </li><li> Incubar durante 48 horas con el anticuerpo primario en solución de bloqueo. Para Iba1-inmunoticción, el uso de conejo anti-Iba1 anticuerpos (1:1000). </li><li> Aclarar las secciones con PBS 3 veces 10 minutos y se incuban en anticuerpo secundario conjugado con biotina (1:1000) en solución de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. Para Iba1-inmunoticción, el uso de cabra anti-conejo IgG. </li><li> Aclarar las secciones con PBS 3 veces 10 minutos y se incuban en estreptavidina-peroxidasa (1:1000) en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Aclarar las secciones con PBS de 10 minutos y con Tris / HCl-buffer salino (TBS, 50 mM, pH 7,4), 2 veces 10 minutos. Para revelar el etiquetado, se incuban las secciones con un 0,05% y 0,01% DAB peróxido de hidrógeno en TBS (solución recién preparada). Cuando la mancha es de color marrón oscuro (ver ejemplo en Figura 1), detener la reacción mediante lavado en TBS. En cualquier caso, poner fin a la reacción después de un máximo de 5 minutos. Aclarar las secciones con TBS 10 minutos y con PB 2 veces 10 minutos. </li></ol> 3. Procesamiento para microscopía electrónica <ol><li> Transferencia de las secciones en el PP en una placa de cultivo multipocillo con un pincel fino. Prepare una solución de tetróxido de osmio% en PB bajo una campana echando humo. Quitar PB de los pozos de la placa de cultivo y difundir las secciones planas con un pincel fino. Secciones inmediatamente sumergirse en el 1% de osmio durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Transferencia de las secciones en viales de vidrio, enjuague con PB 3 veces 10 minutos, y se deshidratan a través de dos inmersiones minutos en subir las concentraciones de etanol: 2 veces el 35%, una vez cada uno de 50%, 70%, 80%, 90% y el 95 %, 3 veces al 100%, seguido por tres veces de óxido de propileno. </li><li> Para preparar la resina Durcupan, se combinan 20 g del componente A, 20 g de componente B, 0,6 g de componente C, y 0,4 g de componente D en un vaso desechable, mezclar bien hasta que el color se vuelve uniforme, y se vierte en una lata de aluminio pesan plato. Si es necesario, los bloques de resina se puede preparar mediante el vertido de resina en los moldes y la incrustación de curado en un horno a 55 ° C durante 48-72 horas. </li><li> El uso de un pincel fino enjuagarse con óxido de propileno, eliminar las secciones del óxido de propileno y sumergirse en la resina de impregnación Durcupan durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Al día siguiente, poner el aluminio pesar la cápsula en un horno a 55 ° C durante 10 minutos para ablandar la resina. El uso de un cepillo de enjuagarse con óxido de propileno, una película de capa de incrustación ACLAR con una fina capa de resina, establecer las secciones, cubrir con otra película de inserción, y distribuir uniformemente el peso ligero (alrededor de 2 g, por ejemplo las tapas de plástico de los viales de vidrio) en la parte superior para ayudar a la difusión de resina. De polimerización de la resina, se incuban en el horno durante 48-72 horas (a 55 ° C). </li><li> Después de la polimerización, quite los pesos ligeros y el cine incrustar en la parte superior de las secciones. Bajo un microscopio binocular, seleccionar las áreas de interés cuadrados (aproximadamente 2x2 mm) y con cuidado especial de la película con una cuchilla de afeitar. </li><li> Pegue las áreas de interés en la punta de bloques de resina con un pegamento y la curación en el 55 ° C horno durante 1 hora. </li><li> En preparación para el corte, recorte el bloque de resina a la forma de un trapecio isósceles con una cuchilla de afeitar. </li><li> El uso de un ultramicrótomo y un cuchillo de vidrio, quitar el pegamento y la resina en la superficie del tejido. Llenar el bote de la cuchilla de vidrio con agua destilada y cortar algunos semi-secciones delgadas (0,5 a 1 m de espesor). </li><li> Transferencia de las secciones a una diapositiva SuperFrost con un bucle perfecto. Seca las secciones mediante la colocación de la diapositiva en una placa de calentamiento a 80 º C durante 1 minuto. Cubrir con unas gotas de 0,1% la mancha azul de toluidina (2 g de borato de sodio y 0,2 g de azul de toluidina en 200 ml de agua bidestilada) durante 1 minuto. Enjuague el exceso de colorante con agua destilada. El examen de las secciones con un microscopio de luz permitirá distinguir los tejidos teñidos de la resina (Figura 2). </li><li> Reanudar el corte hasta la frontera entre el tejido y la resina llega a la mitad de las secciones. Tenga en cuenta que el siguiente procedimiento requiere de un entrenamiento. Vuelva a colocar el cuchillo de vidrio con un cuchillo de diamante y llenar el bote con agua destilada. Tazón de plata de cortes ultrafinos de oro y plata (60-80 nm de espesor) y con cuidado se acumulan en las redes de malla de cobre con unas pinzas finas invertido. Seca las redes en un papel filtro. </li><li> Para mejorar el contraste, las secciones ultrafinas pueden ser teñidas con citrato de plomo (0,03 g citrato de plomo y 0,1 ml de hidróxido de sodio 10 N en 10 ml de agua destilada doble 1). Utilizando unas pinzas finas invertida, la transferencia de una red a una caída del citrato de plomo durante 2 minutos. Retire la rejilla y delicadamente enjuague con tres baños sucesivos de agua destilada. Por último, secar las redes en un papel de filtro y almacenarlas en una celda de la malla hasta que el examen de microscopía electrónica (Figuras 3-6). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Iba1 manchado de la sección a nivel microscópico de luz. La distribución de celulares Iba1 se limita a la microglía, lo que demuestra la especificidad de la tinción. Barra de escala = 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Toluidina azul manchado de semi-sección delgada a nivel microscópico de luz. Nota de la frontera entre el tejido y la resina en la inmunomarcación se parecen más intensos en el microscopio electrónico. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Ultrafinos sección que muestra Iba1-inmunopositivas pericarion la microglia y los procesos a nivel de microscopía electrónica. Elementos estructurales Iba1 positivos se reconocen por su inmunoperoxidasa-DAB electrón-densos precipitado. Barra de escala = 2 micras. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Ultrafinos sección mostrando Iba1-inmunopositivas procesos microgliales de diferentes tamaños y formas a nivel de microscopía electrónica. Barra de escala = 2 micras. e 5 "/&gt; Figura 5. Sección ultrafina que muestra a mayor aumento de un proceso microglial Iba1 positivo en la Figura 4, que permita la identificación de los organelos intracelulares. Barra de escala = 1 micra. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Ultrafinos sección revelar a mayor aumento de las relaciones ultraestructurales entre un proceso de microglial Iba1 positivos y elementos cercanos de neuropilo como sinapsis. Barra de escala = 1μm.

<ol><li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li>
<li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li>
</ol>

Aquí hemos descrito un protocolo de preparación de tejido ratón cerebro para microscopía immunoelectron que proporciona un excelente compromiso entre conservación óptima ultraestructurales y detección inmunocitoquímicas, cuando los procedimientos son rigurosamente realizado. Combinado con TEM, este método permite distinguir elementos celulares con pocos características distintivas y criterios identificación. En particular, el tinción inmunoperoxidasa-DAB de Iba1 permite identificar microglia...

* Siempre se debe trabajar bajo una campana de humos y usar guantes de nitrilo al manipular la acroleína, paraformaldehído, y el osmio y también debe disponer de sus residuos adecuadamente.

preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) es extremadamente útil para la visualización de los compartimentos microglial, subcelular oligodendrocíticos, astrocitos y neuronas (las dendritas, la espina dendrítica, axón, axón terminal, pericarion), así como sus organelos intracelulares y el citoesqueleto, en el sistema nervioso central en alta resolución espacial. En combinación con TEM, pre-incrustación inmunocitoquímica permite la discriminación de los elementos celulares con algunos rasgos distintivos y los criterios de identificación (por ejemplo, la microglia perikarya y procesos, cuando se utiliza un anticuerpo contra el marcador de microglia específicos Iba1 (molécula ionizada de unión de calcio adaptador 1, tal como se presenta aquí)), la identificación de los contenidos de neurotransmisores de los elementos celulares (por ejemplo, serotoninérgicos) y su localización ultraestructural de las proteínas solubles o de membrana (por ejemplo, 5 HT1A y los receptores de EphA4). Aquí se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de ratones con acroleína fijador, la eliminación y la sección del cerebro, así como inmunoperoxidasa-tinción Diaminobencidina (DAB), la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen de TEM. Cuando se realiza con rigor, esta técnica proporciona un excelente compromiso entre la conservación óptima ultraestructurales y detección inmunohistoquímica.

Se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de los ratones, la eliminación y la sección del cerebro, así como la tinción con inmunoperoxidasa, la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen con microscopio electrónico de transmisión.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

La microscopía electrónica de transmisión (MET) es extremadamente útil para visualizar los compartimentos subcelulares de la microglía, los oligodendrocitos, los astrocitos y las neuronas...

El objetivo general de este procedimiento es preparar tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica inmunológica. Esto se logra primero fijando el cerebro mediante perfusión del animal. El segundo paso del procedimiento consiste en cortar el cerebro y procesar las secciones para inmunohistoquímica.El tercer paso del procedimiento consiste en osificar, deshidratar e incluir las secciones. El paso final del procedimiento es cortar secciones ultradelgadas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran con alta resolución espacial la distribución de diversas proteínas dentro de diferentes regiones y tipos celulares del sistema nervioso central.Hola, soy Maria Trombley del Laboratorio de Esca en el Departamento de Neurobiología y Anatomía de la Universidad de Rochester. Hoy les mostraré un procedimiento para la preparación del tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica inmunológica. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las interacciones entre microglía y sinapsis durante el desarrollo, la plasticidad dependiente de la experiencia y el envejecimiento.Entonces, comencemos. Después de fijar el cerebro del ratón mediante perfusión intracardiaca, postfíjelo en aproximadamente 10 mililitros de formaldehído a cuatro grados Celsius durante dos horas. Lave el cerebro a cuatro grados Celsius con una vez PBS tres veces durante 10 minutos cada lavado utilizando un vibrador y PBS frío con hielo; corte inmediatamente el cerebro en secciones transversales de 50 micrones.Utilice un pincel fino para transferir las secciones seleccionadas a un vial de vidrio lleno con cuatro grados Celsius. Almacene las secciones restantes en XPBS con crioprotector a menos 20 grados Celsius durante varios años sin alteración. Procese un máximo de 10 secciones libres flotantes para tinción en cada vial de vidrio.Utilice una pipeta de transferencia para reemplazar el XPBS con 0,1 % de borohidruro de sodio fresco en PBS; cambie las soluciones rápidamente para evitar que los cortes se sequen. Incube durante 30 minutos, enjuague los cortes con XPBS una vez durante 3 períodos de 10 minutos cada uno. Tenga cuidado de eliminar todas las burbujas y bloquee con XPBS que contenga 0,5 % de gelatina y 5 % de suero normal, adecuado para el anticuerpo secundario que se utilizará.Incubar durante dos horas. Añadir el anticuerpo primario diluido en la solución bloqueante. Incubar durante 48 horas.Lave con un XPB S tres veces durante 10 minutos. Incube cada uno con el anticuerpo secundario conjugado con biotina diluido en solución bloqueadora durante dos horas. Lave tres veces durante 10 minutos en un XPBS como antes.Incubar con estreptavidina peroxidasa de rábano picante diluida en solución bloqueante durante una hora. Enjuagar las secciones una vez en XPBS 1X y dos veces en XTBS 1X durante 10 minutos cada vez. Para revelar la marcación, incubar las secciones con una solución recién preparada que contenga dab al 0,05 % y peróxido de hidrógeno al 0,01 % en XTBS 1X.Cuando la tinción sea visiblemente marrón oscuro o la reacción haya durado cinco minutos, enjuague los cortes con un XTBS para detener la reacción. Luego, enjuague una vez con un XTBS y dos veces con un x PB durante 10 minutos cada vez. En una campana extractora, use un pincel fino para transferir los cortes a una placa de cultivo de múltiples pocillos llena con un XPB.Retire el PB de un pocillo utilizando un pincel fino para extender inmediatamente los cortes de forma plana. Añada una solución de 1 % de óxido de osmio en PB 1x antes de pasar al siguiente pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera los cortes de ósmio a viales de vidrio.Lave con un XPB tres veces durante 10 minutos. Deshidrate las secciones en concentraciones crecientes de etanol. Luego, use óxido de propileno como se describe en la sección de texto de este protocolo.Utilice un pincel fino enjuagado con óxido de propileno para transferir las secciones a resina dupant recién preparada. Para la impregnación nocturna, coloque el recipiente que contiene las secciones en un horno a 55 grados Celsius durante 10 minutos. Para ablandar la resina, utilice un pincel enjuagado con óxido de propileno para recubrir una película de inclusión de cloro con una capa delgada de resina.Transfiera el corte a la película y cúbralo con otra película de inclusión de manera uniforme. Distribuya pesos ligeros de aproximadamente dos gramos en la parte superior para ayudar a que la resina se extienda. Permita que la resina polimerice a 55 grados Celsius durante 48 a 72 horas en una incubadora. Después de la polimerización, retire los pesos en la capa superior de la película de inclusión bajo un microscopio binocular.Seleccione áreas de interés de dos por dos milímetros y utilice una cuchilla de afeitar para extraerlas de la película. Pegue con Super Glue las áreas de interés a las puntas de bloques de resina. Incube en un horno a 55 grados Celsius durante una hora.Utilice una cuchilla de afeitar para recortar el bloque de resina en forma de un trapecio isósceles, la forma óptima para la succión ultrafina. Con un microtomo y una cuchilla de vidrio, retire el pegamento de la superficie del tejido para obtener una superficie plana. Para la succión.Llene la embarcación de la cuchilla de vidrio con agua doblemente destilada y corte algunas secciones entre 0,5 y un micrón. Utilice un lazo perfecto para transferir las secciones a un portaobjetos super frost. Seque en una placa calefactora a 80 grados Celsius durante un minuto y tiña con azul de turolina al 0,1 % durante un minuto.Utilice una botella de spray para enjuagar con agua doblemente destilada el exceso de tinción. Examine las secciones bajo un microscopio óptico para distinguir el tejido teñido de la resina. Corte secciones semirrígidas hasta que el borde entre el tejido y la resina alcance aproximadamente el centro de la sección. Sustituya el cuchillo de vidrio por un cuchillo de diamante y llene la barquilla con agua doblemente destilada.Corte la plata hasta obtener láminas ultradelgadas de color plateado a dorado. Seccione cortes de 60 a 80 nanómetros de grosor. Utilice pinzas finas invertidas para recoger cuidadosamente los cortes sobre rejillas de malla de cobre.Seque las rejillas sobre papel filtro para mejorar el contraste. Utilice pinzas finas invertidas para transferir una rejilla a una gota de citrato de plomo durante dos minutos. Enjuague delicadamente la rejilla sumergiéndola en tres baños sucesivos de agua doblemente destilada.Seque el portaobjetos en papel de filtro y guárdelo en una caja para portaobjetos para su posterior examen en el microscopio electrónico. Examine los portaobjetos en el microscopio electrónico para visualizar la inmunotinción, así como la morfología de los elementos celulares, sus orgánulos intracelulares y las relaciones entre ellos.Aquí se muestra una inmunotinción representativa para IBA uno a nivel microscópico de luz. La distribución celular de IBA uno está restringida a la microglía, lo que confirma su especificidad a nivel microscópico electrónico. Se observan la microglía y sus procesos inmunomarcados para IBA uno.La tinción inmunoperoxidasa con DAB aparece como un precipitado electrondenso. Otros ejemplos de IBA1, procesos microgliales inmunomarcados, muestran diferentes tamaños y formas. Un mayor aumento revela diversas organelas intracelulares dentro de uno de los procesos microgliales, así como las relaciones ultraestructurales entre otro proceso microglial y elementos cercanos del neuropilo, incluyendo sinapsis.Acabamos de mostrarle cómo preparar tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica inmunológica. Al realizar este procedimiento, es importante recordar seguir rigurosamente todos los pasos y manipular el tejido cerebral con delicadeza. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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