Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

El objetivo general de este procedimiento es preparar tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica inmunológica. Esto se logra primero fijando el cerebro mediante perfusión del animal. El segundo paso del procedimiento consiste en cortar el cerebro y procesar las secciones para inmunohistoquímica.

El tercer paso del procedimiento consiste en osificar, deshidratar e incluir las secciones. El paso final del procedimiento es cortar secciones ultradelgadas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran con alta resolución espacial la distribución de diversas proteínas dentro de diferentes regiones y tipos celulares del sistema nervioso central.

Hola, soy Maria Trombley del Laboratorio de Esca en el Departamento de Neurobiología y Anatomía de la Universidad de Rochester. Hoy les mostraré un procedimiento para la preparación del tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica inmunológica. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las interacciones entre microglía y sinapsis durante el desarrollo, la plasticidad dependiente de la experiencia y el envejecimiento.

Entonces, comencemos. Después de fijar el cerebro del ratón mediante perfusión intracardiaca, postfíjelo en aproximadamente 10 mililitros de formaldehído a cuatro grados Celsius durante dos horas. Lave el cerebro a cuatro grados Celsius con una vez PBS tres veces durante 10 minutos cada lavado utilizando un vibrador y PBS frío con hielo; corte inmediatamente el cerebro en secciones transversales de 50 micrones.

Utilice un pincel fino para transferir las secciones seleccionadas a un vial de vidrio lleno con cuatro grados Celsius. Almacene las secciones restantes en XPBS con crioprotector a menos 20 grados Celsius durante varios años sin alteración. Procese un máximo de 10 secciones libres flotantes para tinción en cada vial de vidrio.

Utilice una pipeta de transferencia para reemplazar el XPBS con 0,1 % de borohidruro de sodio fresco en PBS; cambie las soluciones rápidamente para evitar que los cortes se sequen. Incube durante 30 minutos, enjuague los cortes con XPBS una vez durante 3 períodos de 10 minutos cada uno. Tenga cuidado de eliminar todas las burbujas y bloquee con XPBS que contenga 0,5 % de gelatina y 5 % de suero normal, adecuado para el anticuerpo secundario que se utilizará.

Incubar durante dos horas. Añadir el anticuerpo primario diluido en la solución bloqueante. Incubar durante 48 horas.

Lave con un XPB S tres veces durante 10 minutos. Incube cada uno con el anticuerpo secundario conjugado con biotina diluido en solución bloqueadora durante dos horas. Lave tres veces durante 10 minutos en un XPBS como antes.

Incubar con estreptavidina peroxidasa de rábano picante diluida en solución bloqueante durante una hora. Enjuagar las secciones una vez en XPBS 1X y dos veces en XTBS 1X durante 10 minutos cada vez. Para revelar la marcación, incubar las secciones con una solución recién preparada que contenga dab al 0,05 % y peróxido de hidrógeno al 0,01 % en XTBS 1X.

Cuando la tinción sea visiblemente marrón oscuro o la reacción haya durado cinco minutos, enjuague los cortes con un XTBS para detener la reacción. Luego, enjuague una vez con un XTBS y dos veces con un x PB durante 10 minutos cada vez. En una campana extractora, use un pincel fino para transferir los cortes a una placa de cultivo de múltiples pocillos llena con un XPB.

Retire el PB de un pocillo utilizando un pincel fino para extender inmediatamente los cortes de forma plana. Añada una solución de 1 % de óxido de osmio en PB 1x antes de pasar al siguiente pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera los cortes de ósmio a viales de vidrio.

Lave con un XPB tres veces durante 10 minutos. Deshidrate las secciones en concentraciones crecientes de etanol. Luego, use óxido de propileno como se describe en la sección de texto de este protocolo.

Utilice un pincel fino enjuagado con óxido de propileno para transferir las secciones a resina dupant recién preparada. Para la impregnación nocturna, coloque el recipiente que contiene las secciones en un horno a 55 grados Celsius durante 10 minutos. Para ablandar la resina, utilice un pincel enjuagado con óxido de propileno para recubrir una película de inclusión de cloro con una capa delgada de resina.

Transfiera el corte a la película y cúbralo con otra película de inclusión de manera uniforme. Distribuya pesos ligeros de aproximadamente dos gramos en la parte superior para ayudar a que la resina se extienda. Permita que la resina polimerice a 55 grados Celsius durante 48 a 72 horas en una incubadora. Después de la polimerización, retire los pesos en la capa superior de la película de inclusión bajo un microscopio binocular.

Seleccione áreas de interés de dos por dos milímetros y utilice una cuchilla de afeitar para extraerlas de la película. Pegue con Super Glue las áreas de interés a las puntas de bloques de resina. Incube en un horno a 55 grados Celsius durante una hora.

Utilice una cuchilla de afeitar para recortar el bloque de resina en forma de un trapecio isósceles, la forma óptima para la succión ultrafina. Con un microtomo y una cuchilla de vidrio, retire el pegamento de la superficie del tejido para obtener una superficie plana. Para la succión.

Llene la embarcación de la cuchilla de vidrio con agua doblemente destilada y corte algunas secciones entre 0,5 y un micrón. Utilice un lazo perfecto para transferir las secciones a un portaobjetos super frost. Seque en una placa calefactora a 80 grados Celsius durante un minuto y tiña con azul de turolina al 0,1 % durante un minuto.

Utilice una botella de spray para enjuagar con agua doblemente destilada el exceso de tinción. Examine las secciones bajo un microscopio óptico para distinguir el tejido teñido de la resina. Corte secciones semirrígidas hasta que el borde entre el tejido y la resina alcance aproximadamente el centro de la sección. Sustituya el cuchillo de vidrio por un cuchillo de diamante y llene la barquilla con agua doblemente destilada.

Corte la plata hasta obtener láminas ultradelgadas de color plateado a dorado. Seccione cortes de 60 a 80 nanómetros de grosor. Utilice pinzas finas invertidas para recoger cuidadosamente los cortes sobre rejillas de malla de cobre.

Seque las rejillas sobre papel filtro para mejorar el contraste. Utilice pinzas finas invertidas para transferir una rejilla a una gota de citrato de plomo durante dos minutos. Enjuague delicadamente la rejilla sumergiéndola en tres baños sucesivos de agua doblemente destilada.

Seque el portaobjetos en papel de filtro y guárdelo en una caja para portaobjetos para su posterior examen en el microscopio electrónico. Examine los portaobjetos en el microscopio electrónico para visualizar la inmunotinción, así como la morfología de los elementos celulares, sus orgánulos intracelulares y las relaciones entre ellos.

Aquí se muestra una inmunotinción representativa para IBA uno a nivel microscópico de luz. La distribución celular de IBA uno está restringida a la microglía, lo que confirma su especificidad a nivel microscópico electrónico. Se observan la microglía y sus procesos inmunomarcados para IBA uno.

La tinción inmunoperoxidasa con DAB aparece como un precipitado electrondenso. Otros ejemplos de IBA1, procesos microgliales inmunomarcados, muestran diferentes tamaños y formas. Un mayor aumento revela diversas organelas intracelulares dentro de uno de los procesos microgliales, así como las relaciones ultraestructurales entre otro proceso microglial y elementos cercanos del neuropilo, incluyendo sinapsis.

Acabamos de mostrarle cómo preparar tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica inmunológica. Al realizar este procedimiento, es importante recordar seguir rigurosamente todos los pasos y manipular el tejido cerebral con delicadeza. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.