Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 3:19 min. • April 30th, 2023
El lentivirus es un retrovirus que contiene material genético de ARN. Este virus proporciona un método eficiente y estable para introducir transgenes en líneas celulares cancerosas. Comience agregando neuraminidasa a un tubo que contiene lentivirus que expresa proteína verde fluorescente, o GFP. Mantenga el tubo a 37 grados centígrados durante una hora para aumentar la eficiencia de unión del virus.
A continuación, centrifuga un tubo que contiene suspensión de células tumorales para formar un pellet. Agregue medios de mamosfera que contengan polibreno para resuspender las células. El policereno es un polímero catiónico que aumenta la eficiencia de la infección lentiviral. Ahora coloque el número óptimo de células tumorales por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos. Agregue la cantidad requerida de Lentivirus en cada pocillo de la placa de cultivo.
Agite la placa para mezclar el contenido y manténgala a 37 grados centígrados durante 96 horas con un suministro continuo de dióxido de carbono. El lentivirus entra en la célula y libera ARN. La transcriptasa inversa viral convierte el ARN en ADN bicatenario que se integra en el genoma del huésped. Coloque la placa bajo un microscopio fluorescente y monitoree las células para una transducción exitosa. Las células transducidas emiten fluorescencia debido a la expresión de GFP.
En el protocolo de ejemplo, realizaremos la transducción de células tumorales disociadas con PDX con vectores lentivirales.
Para transducir las células tumorales, centrifugar las células aisladas para su resuspensión en dos mililitros de medio de mamósfera. Después de contar, vuelva a centrifugar las células y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de medio de mamósfera, complementado con 20 microlitros de polibreno. A continuación, placa 2 veces 10 a la quinta células tumorales viables por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos de adherencia ultra baja y partículas lentivirales a las células en una multiplicidad de infección de 10.
Agite la placa para mezclar el virus con las células e incubar los cocultivos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante un máximo de 96 horas, agregando 500 microlitros de medio de mamosfera fresco después de las primeras 24 horas. Cuando al menos el 10% de las células sean GFP positivas, transfiera las células transducidas de al menos un pocillo a un tubo cónico de 15 mililitros con hielo y lave el pocillo con un mililitro de medio de mamósfera.
Agrupe el lavado con las células y centrifugue las células tumorales en 10 mililitros de HBSS más HEPES. Finalmente, vuelva a suspender las células en 50 microlitros de extracto de matriz basal en hielo y cargue las células incrustadas en una jeringa de insulina de 0,5 mililitros para su reimplantación.