Disociación mecánica: un método para obtener células viables a partir de un tejido

Primero, pesa un fragmento de tejido y mide su longitud, anchura y altura. Coloque el tejido en una placa de cultivo con un medio de cultivo y córtelo en trozos pequeños con un bisturí. Transfiera todo a un tubo en C para homogeneizar con una pipeta Pasteur.

Coloque el tubo en un disociador mecánico y ejecute los ciclos según sea necesario. El aparato utiliza fuerzas mecánicas para extraer células individuales viables de la muestra de tejido mientras mantiene la integridad celular, incluidas las proteínas de la superficie. Decantar el homogeneizado a través de un colador de células fijado en un tubo de centrífuga.

Vuelva a homogeneizar el tejido restante y cuele el homogeneizado a través del filtro de células en el tubo. Centrifugar el homogeneizado y eliminar el sobrenadante. Ahora, vuelva a suspender el pellet celular en el medio de cultivo y transfiera una pequeña cantidad de la suspensión celular a un tubo que contenga tinción de azul de tripano.

Después de la tinción, transfiera las células a un portaobjetos de hemocitómetro. Cuente las células viables transparentes. Las células muertas absorben la mancha, ya que su membrana celular no está intacta. En el siguiente protocolo, realizaremos la disociación no enzimática de tejido humano fresco para el análisis cuantitativo y cualitativo de células CD45+.

- Comience pesando la muestra de tejido y luego midiendo la longitud, el ancho y la altura del tejido. A continuación, transfiera el fragmento de tejido a una pequeña placa de Petri que contenga 1 mililitro del medio celular hematopoyético adecuado, sin suero, definido químicamente, y utilice un bisturí estéril para cortar las muestras en trozos pequeños de 1 a 2 milímetros cuadrados. A continuación, transfiera el contenido del plato a un tubo C disociador mecánico y enjuague el plato y el bisturí con 2 mililitros de medio.

Agregue el lavado al tubo C y luego ejecute el programa de disociador mecánico 8.01 dos veces seguidas para homogeneizar suavemente los fragmentos de tejido en una suspensión de una sola célula. Después del segundo ciclo, decantar el homogeneizado a través de un filtro de celdas de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, utilice la misma pipeta Pasteur de lavado de la placa de Petri para transferir cualquier líquido que quede en el tubo C al filtro de células.

A continuación, utilice una micropipeta de 1 mililitro para transferir el líquido filtrado a un tubo cónico de 15 mililitros y enjuague el tubo C con 3 mililitros adicionales de medio. Transfiera este lavado a través del filtro de celdas al tubo de 50 mililitros. A continuación, mueva suavemente el tejido no homogeneizado alrededor del colador con una punta limpia de 1 mililitro para exprimir la máxima cantidad de líquido residual atrapado en el tejido en el tubo de 50 mililitros. Ahora coloque el filtro de células boca abajo sobre el tubo C original y enjuague el filtro con 3 mililitros más de medio para que el tejido no homogeneizado vuelva a caer en el tubo C.

Vuelva a homogeneizar el tejido durante dos ciclos más, como se acaba de demostrar, y luego vierta el segundo homogeneizado a través del filtro celular nuevamente. Enjuague el tubo C con otros 3 mililitros de medio. A continuación, filtre el sobrenadante a través del colador y exprima el líquido residual del tejido, como se acaba de demostrar. En este punto, debe haber un volumen de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensión de una sola célula en el tubo de 15 mililitros, y se deben observar aproximadamente 9 mililitros en el tubo de 50 mililitros.

Para separar el sobrenadante tisular de las células, primero centrifugar ambos tubos de homogeneizado durante 15 minutos a 600 Gs a temperatura ambiente. Decanta el sobrenadante del tubo de 15 mililitros en un tubo de 1,5 mililitros, colocándolo a 4 grados centígrados, y desecha el sobrenadante del tubo de 50 mililitros. A continuación, golpee suavemente cada tubo sobre una superficie dura para romper cada uno de los gránulos de la célula.

Resuspendió el pellet de celda suelta en el tubo de 50 mililitros con 500 microlitros de medio y transfirió las celdas al tubo de 15 mililitros para resuspender el segundo pellet. A continuación, enjuague el tubo de 50 mililitros con otros 500 microlitros de medio y transfiera el lavado al tubo de 15 mililitros para obtener la máxima recuperación de la célula. Después de contar el número de células viables por exclusión de azul de tripano, granule la suspensión celular.

Por último, centrifuga el sobrenadante de tejido reservado. A continuación, transfiera con cuidado el sobrenadante a al menos un tubo limpio sin tocar ni alterar el pellet y guárdelo a menos 80 grados centígrados para futuros análisis posteriores.