Ensayo de formación de colonias de agar blando: un método para probar los efectos de nuevos compuestos en la proliferación de células cancerosas

Para comenzar, tome una concentración adecuada de agarosa fundida en un tubo cónico y agregue la cantidad deseada de medio de cultivo caliente. Invierta suavemente para mezclar el contenido. Agregue esta mezcla en cada pocillo de un plato de seis pocillos y deje que se solidifique. Esta es la capa inferior. A continuación, trate las células cancerosas con el compuesto de interés y agregue la concentración requerida de agarosa.

Ahora, vierta esta mezcla que contiene el número deseado de células por mililitro en cada pocillo. Se trata de una capa que contiene células. Una vez que el medio se solidifique, incube la placa a 37 grados centígrados durante una semana. Prepare una capa alimentadora mezclando agarosa con el medio y complemente esta mezcla con el compuesto de interés. Agregue suavemente esta capa de alimentación en cada pocillo, deje que se solidifique e incube la placa a 37 grados centígrados.

Repita este procedimiento de alimentación semanalmente para reponer las células con el medio hasta que se formen colonias. Si el compuesto de interés es un inhibidor de la tumorigénesis, suprimirá el crecimiento de las células, lo que dará lugar a pocas colonias en los pozos. En el siguiente protocolo, realizaremos un ensayo de formación de colonias de agar blando para estudiar el efecto de los inhibidores de PADI sobre la tumorigénesis de las células de cáncer de mama.

Comience este procedimiento preparando 2-hidroxietil agarosa al 3%. En una botella de vidrio limpia y seca de 100 mililitros, agregue 0,9 gramos de 2-hidroxietil agarosa seguido de 30 mililitros de agua destilada. Calienta la mezcla en el microondas durante 15 segundos y revuelve suavemente. Repite este paso hasta que el polvo de agarosa se disuelva por completo. A continuación, autoclave el frasco contenedor.

Deje que la solución de agarosa se enfríe a temperatura ambiente antes de usarla más. Precalentar varias pipetas de cinco mililitros y 10 mililitros en una incubadora a 37 grados centígrados para evitar que la agarosa se solidifique en la pipeta durante la manipulación. Afloje parcialmente la tapa de la botella y cocine en el microondas la solución prefabricada de 2-hidroxietil agarosa al 3% durante 15 segundos. Luego agite suavemente la solución y cocine en el microondas durante otros 15 segundos.

Tenga cuidado al agitar la solución de agarosa porque la solución se eleva cuando se expone al aire y puede derramarse. Si hay gel sólido residual en la botella, cocine en el microondas durante unos segundos más. Mantenga el frasco que contiene la solución de agarosa en un baño de agua a 45 grados centígrados durante los siguientes pasos para evitar que la solución de agarosa se solidifique prematuramente.

A continuación, transfiera 12 mililitros de medio calentado con las pipetas precalentadas a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Agregue inmediatamente tres mililitros de la solución de agarosa al 3% e invierta suavemente el tubo cónico para mezclar la agarosa con el medio. Luego, agregue suavemente dos mililitros de esta mezcla en cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos sin formar burbujas de aire. Incube la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados centígrados durante una hora para permitir que la mezcla se solidifique.

Después de que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos. La capa inferior ya está lista para su uso.

Un aspecto difícil de este procedimiento es asegurarse de que todas las células se distribuyan por igual y que el gel de agarosa derretido no se solidifique antes de la adición a cada pocillo, para garantizar que las células se mezclen en el medio antes de agregar el gel de agarosa líquido. Además, las pipetas se precalientan de antemano para evitar que las soluciones se solidifiquen durante la manipulación.

Para preparar la capa que contiene la célula, primero tripsinice MCF10DCIS células y dilúyalas hasta una concentración celular de 40.000 células por mililitro. A continuación, tome ocho mililitros de medio con pipetas precalentadas y transfiéralo a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Agregue inmediatamente dos mililitros de agarosa al 3% al tubo cónico e invierta suavemente para mezclar la agarosa con el medio. Evite formar burbujas.

A continuación, tome dos mililitros de las células y trátelas con dos micromolares BB-cloro-amidina en DMSO, o DMSO solo como control. Después del tratamiento, mezcle las células con una agarosa al 0,6% en una dilución uno a uno para hacer una concentración final de un micromolar BB-chlor-amidina. A continuación, tome un mililitro de la mezcla de células y agarosa y añádalo suavemente a la capa inferior de la placa de cultivo de seis pocillos.

Coloque la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados centígrados durante al menos 15 minutos para permitir que la capa superior se solidifique. Después de que la mezcla se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante una semana antes de agregar la capa de alimentación. Comience la preparación de la capa de alimentación calentando en el microondas la solución prefabricada de 2-hidroxietil agarosa al 3% como antes, y equilibrando la botella de solución de agarosa en un baño de agua a 45 grados centígrados.

Mezcle un mililitro de solución de agarosa al 3% con nueve mililitros de medio tibio en un tubo cónico de 50 mililitros e invierta suavemente para mezclar la agarosa con el medio. Evite formar burbujas de aire. Después de tratar la mezcla con BB-chlor-amidina, agregue suavemente un mililitro de la mezcla en cada pocillo de la placa de cultivo de seis pocillos que contiene las capas inferior y blanda. Luego, coloque la placa de cultivo de seis pocillos horizontalmente sobre una superficie plana a cuatro grados centígrados durante al menos 15 minutos para permitir que la mezcla se solidifique.

Después de que la capa del alimentador se solidifique, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados. Repita este procedimiento de alimentación semanalmente superponiendo un mililitro de solución de tratamiento de medio de agarosa al 0,3% sobre la capa de alimentación existente para reponer las celdas con nuevos medios hasta que se observe la formación de colonias.