Almohadillas de grasa mamaria descelularizantes: Obtención de hidrogeles de matriz extracelular a partir de almohadillas de grasa mamaria

En primer lugar, coloque las almohadillas de grasa mamaria o las MFP en una placa con solución de tripsina-EDTA e incube durante el tiempo deseado para romper las adherencias de la matriz celular. Lave las impresoras multifunción con agua desionizada y cuélelas a través de un colador. Coloque los pañuelos de papel en un vaso de precipitados con una barra para remover y agregue Triton X-100. Agitar para lisar las células sin afectar a los factores de crecimiento de la matriz extracelular del tejido.

Cuele las impresoras multifunción y enjuague con agua desionizada. Transfiera los tejidos de nuevo al vaso de precipitados y agregue ácido desoxicólico para lisar las células restantes. A continuación, cuele las impresoras multifunción y colóquelas en un vaso de precipitados que contenga agua desionizada con penicilina-estreptomicina para evitar la contaminación. Incubar el vaso a 4 grados centígrados durante la noche.

Cuele las impresoras multifunción y colóquelas en un vaso de precipitados que contenga etanol y ácido peracético. El ácido peracético aumenta la rigidez de la matriz extracelular del tejido. Revuelva durante un tiempo y repita el paso de colado. Lave las impresoras multifunción con PBS y luego con agua desionizada. Transfiera las impresoras multifunción coladas a un vaso de precipitados que contenga propano-1-ol.

Revuelva durante algún tiempo, cuele el contenido y lave las impresoras multifunción con agua desionizada. Seque las impresoras multifunción y guárdelas a menos 80 grados centígrados. En el siguiente protocolo, realizaremos la descelularización de las almohadillas de grasa mamaria murina.

En primer lugar, coloque las impresoras multifunción en platos de seis centímetros con cinco mililitros de solución de tripsina-EDTA. Rocíe y limpie los platos con etanol al 70% e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Utilice filtros de 0,7 milímetros para lavar las impresoras multifunción con agua desionizada vertiendo agua sobre el pañuelo tres veces. Use fórceps para masajear manualmente el tejido entre lavados.

A continuación, seque brevemente el pañuelo en una toallita delicada y péselo. Coloque los pañuelos secos en un vaso de precipitados preesterilizado en autoclave que contenga una barra de agitación de tamaño adecuado y cubra los pañuelos con 60 mililitros de polietoxietanol t-octilfenoxi al 3% por gramo de tejido. Revuelva durante una hora a temperatura ambiente. Luego, vierta el contenido de los vasos en un colador.

Enjuague el vaso de precipitados con agua desionizada y viértala sobre los pañuelos de papel. Repita este proceso de enjuague dos veces más, asegurándose de usar pinzas para masajear manualmente el tejido entre enjuagues. Después de esto, seque brevemente el pañuelo en una toallita y pesaje delicado. Vuelva a colocar los pañuelos y las barras revolventes en los mismos vasos de precipitados y cúbralos con 60 mililitros de ácido desoxicólico al 4% por gramo de tejido. Revuelva a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, vierta el contenido del vaso de precipitados en un colador de malla. Enjuague el vaso de precipitados con agua desionizada y viértala sobre los pañuelos de papel. Repita este proceso de enjuague dos veces más, asegurándose de usar pinzas para masajear manualmente el tejido entre enjuagues. Seque brevemente el pañuelo enjuagado en una toallita delicada y péselo.

Coloque los pañuelos secos en el mismo vaso de precipitados junto con agua fresca desionizada suplementada con estreptomicina de penicilina al 1%. Cubra bien el vaso de precipitados con una película de parafina y déjelo a 4 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, escurre el contenido del vaso en un colador. Seque brevemente el pañuelo en una toallita delicada y péselo. A continuación, coloque las impresoras multifunción en el mismo vaso de precipitados con una barra de agitación del tamaño adecuado.

Cubra el tejido con 60 mililitros de una solución que contenga un 4% de etanol y un 0,1% de ácido peracético por gramo de tejido. Revuelva a temperatura ambiente durante dos horas. Vierte el contenido del vaso de precipitados en un colador de 0,7 milímetros. Use pinzas para masajear manualmente el pañuelo y vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lave el pañuelo cubriéndolo con 60 mililitros de 1X PBS por gramo de pañuelo.

Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repite todo este proceso de lavado una vez más. A continuación, vierta el contenido del vaso de precipitados en un colador de 0,7 milímetros. Con unas pinzas, masajee manualmente el pañuelo y vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lave el pañuelo cubriéndolo con 60 mililitros de agua desionizada por gramo de pañuelo.

Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repite todo este proceso de lavado una vez más. Seque brevemente el pañuelo lavado en una toallita delicada y péselo. Vierta el pañuelo y el contenido en un colador y use fórceps para masajear manualmente el tejido. Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados y cubra los pañuelos con 60 mililitros de n-propanol al 100% por gramo de tejido.

Revuelva a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, seca brevemente el pañuelo en una toallita delicada y pésalo. Vierta el pañuelo y el contenido en un colador de 0,7 milímetros y use pinzas para masajear manualmente el tejido. Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados y lave el pañuelo cubriéndolo con 60 mililitros de agua desionizada por gramo de tejido.

Revuelva a temperatura ambiente durante 15 minutos. Repite este proceso de lavado tres veces. Después de esto, seque brevemente el pañuelo en una toallita delicada y péselo. Transfiera el tejido a un tubo de 15 mililitros marcado y congele a menos 80 grados centígrados durante la noche.