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- Para comenzar, diluya las células tumorales circulantes aisladas o CTC a la concentración requerida utilizando una solución antiadherente que proteja las células del cizallamiento del líquido y el daño por presión. A continuación, ensamble un portaobjetos de microscopio recubierto de polilisina y una tarjeta de filtro de citocentrífuga en un conjunto de embudo de citocentrífuga. Transfiera la suspensión de la celda al puerto del embudo del ensamblaje seguido de la citocentrifugación.
La fuerza centrífuga concentra y deposita una monocapa de células en un área circular en el portaobjetos. Aísle el área depositada con células usando un aislador de silicona. Una vez secas, fije las células con paraformaldehído. A continuación, incube las células con una solución de bloqueo adecuada que contenga proteínas que se unan fácilmente a cualquier sitio de unión no específico en la superficie celular.
Ahora, etiquete las células con una solución de anticuerpos marcada con fluorescente de interés. Los anticuerpos marcados con fluoróforos reconocen y se unen a moléculas diana específicas en la superficie celular. Lave la muestra para eliminar los anticuerpos no unidos. Agregue una solución de montaje para preparar la muestra para la obtención de imágenes.
Utilice un microscopio de fluorescencia para detectar la luz emitida por los conjugados anticuerpo-fluoróforo unidos a los antígenos diana en las CTC. En este protocolo, realizaremos un ensayo de inmunofluorescencia de CTC en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.
- Para la tinción con inmunofluorescencia, cuente las células en un hemocitómetro y diluya la muestra enriquecida a 1 veces 10 a la quinta célula por cada 100 microlitros de concentración de solución antiadherente al 0,2%. A continuación, utilice un bastoncillo de algodón empapado con 50 microlitros de solución antiaglutinante para humedecer el contorno de la cámara de muestras y coloque un portaobjetos de vidrio de polilisina en la cámara de muestras.
Cierre la cámara y pipetee hacia arriba y hacia abajo tres veces para cubrir la punta de una micropipeta con la solución aglutinante antes de volver a suspender la muestra en los últimos 100 microlitros del sobrenadante. Transfiera la solución celular a la cámara de muestras y cigire la muestra en una centrífuga dedicada a 400 rotaciones por minuto durante 4 minutos a baja aceleración.
Al final de la centrifugación, coloque un aislador de silicona alrededor del área de deposición y deje que la corredera se seque bajo una cabina de seguridad microbiológica durante dos minutos. A continuación, fije la muestra de citospun con 100 microlitros de paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguidos de tres lavados de 2 minutos con 200 microlitros de PBS por lavado a temperatura ambiente.
Después del último lavado, bloquee cualquier unión inespecífica con una incubación de 30 minutos en el reactivo de bloqueo a temperatura ambiente, seguida de un marcado con 100 microlitros de la solución de anticuerpos de interés. Coloque el portaobjetos etiquetado en una placa de Petri de 100 por 15 mililitros sobre un trozo de papel absorbente humedecido con 2 mililitros de agua estéril y coloque la placa cerrada a 4 grados centígrados durante la noche, protegida de la luz.
A la mañana siguiente, lave la muestra tres veces con PBS, como se demuestra, y monte la muestra con 10 microlitros de una solución de montaje adecuada y un cubreobjetos de vidrio. A continuación, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.