Inflado de agarosa en todo el pulmón: un método de preparación de los pulmones para la obtención de imágenes en vivo ex vivo

- Primero, coloque un ratón sacrificado en una tabla de disección. Justo encima del abdomen, corte a través de la piel y el peritoneo. Perfore el diafragma y corte a lo largo de las costillas y la caja torácica hasta la tráquea. Haz una pequeña incisión en la tráquea. Inserte suavemente una aguja dentro de la tráquea sin lesionar la carina y asegúrela con pinzas. Inyecte agarosa de bajo punto de fusión a temperatura corporal normal dentro de los pulmones. Retire lentamente la jeringa y mantenga la aguja adentro para evitar el reflujo de agarosa.

Vierta PBS frío en los pulmones para promover la gelificación de la agarosa. Retire la aguja y sujete la tráquea con pinzas para evitar el reflujo de agarosa no solidificada. Corta el esternón, sujeta la tráquea con pinzas y córtala con unas tijeras. Extrae los pulmones de la cavidad torácica. Separe los lóbulos en el medio. Colocar dentro de pozos de imágenes en condiciones fisiológicas para microscopía. La agarosa preserva la morfología pulmonar a temperaturas fisiológicas que ayudan a observar las interacciones celulares vivas. En el siguiente protocolo, demostraremos imágenes en vivo ex vivo de pulmones para estudiar las interacciones entre las células cancerosas y las células estromales.

- Para preparar los pulmones para la obtención de imágenes en vivo ex vivo, comience por inmovilizar al ratón en una tapa de espuma de poliestireno cubierta con un trozo de remojo y esterilice al animal con etanol al 70%. A continuación, con unas tijeras quirúrgicas, realice una incisión epigástrica transversal a través de la piel, seguida de una incisión similar a través del peritoneo. Luego, moviendo la tabla de disección a una posición vertical, corte la aorta descendente para que la sangre se acumule en el abdomen y no en la cavidad torácica.

Corta una pequeña abertura en el diafragma para liberar el vacío, luego corta a lo largo de la caja torácica para extirpar el diafragma y visualizar los pulmones. Con unas tijeras quirúrgicas, corte la piel hasta la tráquea sobre la caja torácica, dejando las costillas intactas. A continuación, separe la piel de la caja torácica y retire el tejido conectivo circundante para exponer la tráquea, teniendo cuidado de no dañar la propia tráquea. Corte una pequeña abertura de aproximadamente 1 milímetro de diámetro en la tráquea expuesta paralela a los anillos cartilaginosos lo más cerca posible de la laringe, sin cortar completamente la tráquea.

A continuación, inserte suavemente una aguja de calibre 20 de 4 a 5 milímetros en la tráquea sin ninguna contrafuerza. El extremo de la aguja debe ser visible a través de la tráquea. Llene una jeringa con 400 microlitros de agarosa a 37 grados Celsius al 2% a baja temperatura de fusión y luego estabilice la aguja con pinzas. Manteniendo la tabla de disección vertical, instilar lentamente toda la cantidad de agarosa tibia a través de la aguja hacia los pulmones. Una vez que los pulmones estén inflados, separe la jeringa mientras mantiene la aguja dentro de la tráquea y vierta aproximadamente 50 mililitros de PBS de 20 grados Celsius sobre los pulmones para ayudar a fijar la agarosa.

Cuando la agarosa se haya solidificado, retire la aguja y use fórceps para cerrar la tráquea y evitar la fuga de cualquier agarosa no solidificada. Ahora, abra aún más el tórax mediante esternotomía y agarre la tráquea con fórceps. Luego, con un par de tijeras quirúrgicas, corte la tráquea por completo. Para extirpar los pulmones, tire suavemente de la tráquea hacia arriba, corte el tejido conectivo y el esófago, y extraiga los pulmones por completo de la cavidad torácica.

Sumerja el pañuelo en 37 grados centígrados RPMI 1640 para lavar el exceso de sangre. Con unas tijeras y fórceps, corte el bronquio del tallo principal de los lóbulos en el hilio y separe suavemente los lóbulos pulmonares. Transfiera los lóbulos a un pocillo de una placa de imagen de 24 pocillos, con una superficie plana hacia abajo y cubra el tejido con 100 microlitros de 37 grados Celsius RPMI 1640. Coloque varios portaobjetos de cubierta de microscopio circular de 15 mililitros en la parte superior de los lóbulos para evitar que floten, y vierta PBS tibio en los pocillos circundantes para evitar que el medio se evapore. A continuación, inserte la placa de 24 pocillos en la cámara climática y transfiera la cámara a la platina del microscopio confocal.