¿Por qué es fundamental la determinación de la CI50 antes de la escalada de dosis?

El establecimiento de la IC50 basal mediante el ensayo MTT proporciona la concentración de referencia para iniciar la escalada de dosis en 1/10 de la IC50, asegurando que se aplique una presión selectiva sin citotoxicidad inmediata. Esto permite un desarrollo gradual de resistencia a lo largo del tiempo, en lugar de una muerte celular aguda.

¿Cómo informa el resultado del ensayo MTT sobre el desarrollo de resistencia?

El ensayo MTT mide la producción de formazán a partir de la actividad de la reductasa mitocondrial en células viables, siendo la densidad óptica a 570 nm proporcional al número de células; se confirma la resistencia cuando las células mantienen su viabilidad a concentraciones crecientes de afatinib que inicialmente inhibieron el crecimiento.

¿Qué permite la replicación confiable del desarrollo de líneas celulares resistentes?

La escalada progresiva de dosis en subconfluencia, con aumentos de concentración del 10-20 % en cada paso, proporciona un protocolo estandarizado de presión selectiva que puede replicarse en diferentes laboratorios para generar modelos isogénicos resistentes.

¿Por qué son esenciales los requisitos de replicación para la colaboración multifuncional?

El desarrollo consistente de resistencia en réplicas asegura que los fenotipos observados estén impulsados genéticamente en lugar de ser estocásticos, lo que permite una transferencia confiable entre los equipos de descubrimiento, desarrollo de ensayos y preclínicos para estudios de validación de dianas.

¿Qué análisis estadístico se requiere para confirmar el desarrollo de resistencia?

La resistencia se confirma comparando las curvas de viabilidad obtenidas mediante el ensayo MTT entre células parentales y células con dosis escalonadas, requiriendo pruebas de significación estadística (por ejemplo, análisis del desplazamiento de la CI50) para demostrar una sensibilidad reducida al fármaco con el tiempo.

Aumento de dosis: un método para desarrollar resistencia a los medicamentos en las células cancerosas

JoVE Encyclopedia of Experiments

Investigación sobre el cáncer

0 vistas • 4:17 min • April 30th, 2023

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- Los inhibidores de la tirosina quinasa, TKI, bloquean el receptor de la quinasa para que no se una al ATP, evitando la fosforilación. Comience con la siembra de células cancerosas en medios de crecimiento. Permita que alcancen una densidad favorable y transfieran las células a múltiples pozos. Después del crecimiento durante la noche, dispense diferentes concentraciones de fármaco en varios pocillos y deje que las células crezcan durante el tiempo deseado. Agregue MTT, un tinte soluble en agua, para medir la viabilidad celular. Las enzimas mitocondriales convierten el MTT en formazano púrpura insoluble dentro de las células vivas.

Detenga la reacción añadiendo un agente solubilizante adecuado y mida el formazano espectrofotométricamente. Este método se denomina ensayo MTT. Traza un gráfico de las células vivas indicadas por formazano frente a las concentraciones del fármaco. Calcule la concentración inhibitoria, IC₅₀, encontrando la concentración del fármaco que mata el 50% de las células utilizando el software.

A continuación, cultive células cancerosas en el medio de crecimiento y distribúyalas en tres placas diferentes. Después de que las células alcancen la subconfluencia, agregue 1/10 de dilución de la concentración de IC₅₀. Permita que las células crezcan y realice el ensayo MTT. Repita este proceso aumentando la dosis del medicamento. Las células cancerosas desarrollan lentamente resistencia a los TKI debido a mutaciones en la secuencia de proteínas.

El siguiente protocolo muestra el desarrollo de resistencia a afatinib en células PC9 mediante escalada de dosis.

- Para determinar la concentración adecuada de resistencia a afatinib, se cultivaron células PC9 en medio de crecimiento en una placa tratada con cultivo celular de 10 centímetros a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Resuspenda las células PC9 a una concentración de 4 veces 10 a 4 células por mililitro de medio de crecimiento y siembre las células a 50 microlitros de suspensión de células por pocillo en una microplaca de 96 pocillos. Después de una incubación nocturna en la incubadora de cultivos celulares, tratar las células con 50 microlitros de solución de afatinib por pocillo a seis repeticiones de las concentraciones indicadas. Y después de una incubación de 96 horas en la incubadora de cultivos celulares, agregue 15 microlitros de tinte MTT a cada pocillo.

Después de cuatro horas en la incubadora de cultivos celulares, agregue 100 microlitros de solución de parada de solubilización a cada pocillo y devuelva la placa a la incubadora durante la noche. A la mañana siguiente, mida la densidad óptica a 570 nanómetros en un lector de microplacas. Para la exposición continua a afatinib, cultive células PC9 en placas P100 que contengan 10 mililitros de medio de crecimiento hasta que las células alcancen la subconfluencia.

Transfiera los cultivos subconfluentes a tres nuevas placas P100 de 9 mililitros de medio de crecimiento por placa de cultivo inicial y devuelva las células a la incubadora de cultivos celulares. A la mañana siguiente, agregue 0,1 nanomolar o 1/10 de la concentración inhibitoria máxima media de afatinib a cada conjunto de tres placas de cultivo. Cuando las células tratadas con afatinib se vuelvan subconfluentes, use una pipeta de 1 mililitro para mezclar completamente los cultivos y transfiera 1 mililitro de células de cada placa a 9 mililitros de medio de crecimiento fresco en placas P100 nuevas.

Agregue concentraciones de afatinib de 10 a 20 % más altas a los nuevos cultivos, aumentando la concentración de afatinib mediante un aumento gradual de la dosis cada vez que los cultivos alcancen la subconfluencia durante un período de 10 a 12 meses. Cuando se alcance una concentración de afatinib de 1 micromolar, realice el ensayo MTT según lo demostrado para confirmar que las células han desarrollado resistencia a afatinib.