Ensayo de extracción de ARN: un método para extraer ARN de células de cáncer de pulmón transfectadas con miARN

- Para empezar, siembra las células de cáncer de pulmón en un matraz en T que contenga un medio de cultivo de tejidos y déjalo crecer durante la noche. A continuación, suspenda el miARN con un agente transfector en un medio transfectador. Retire el medio y agregue un medio de transfección que introducirá miARN en las células cancerosas. El miARN es una molécula de ARN no codificante que se une a una secuencia complementaria de ARNm y bloquea la expresión génica. Incubar el matraz durante el tiempo deseado.

A continuación, reemplace los medios con medios de cultivo de tejidos y crezca durante la noche. Agregue tripsina para la disociación celular. Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga que contenga PBS y centrifuérela. Retire el sobrenadante y agregue tampón de lisis para lisar las células y agregue etanol ultrapuro para la precipitación. Coloque la mezcla en una columna separadora para purificar el ácido nucleico y centrifugar.

Retire el flujo y agregue un tampón de lavado para eliminar la membrana celular lisada y la centrífuga. Retire el tampón de lavado y agregue DNasa con tampón de digestión de DNasa para eliminar el ADN de la muestra y la centrífuga. Agregue tampón de preparación de ARN para aislar el ARN y centrifugar. Recoger el ARN presente en el sobrenadante. En el siguiente protocolo, realizaremos la extracción de ARN de células de cáncer de pulmón tratadas con miRNA.

- En primer lugar, siembre las células cancerosas en un matraz adecuado suficiente para la extracción de ARN y proteínas para realizar la expresión génica mediante qPCR o análisis de microarrays. A continuación, incubar durante la noche con medios suplementados con un 10% de FBS y un 1% de penicilina-estreptomicina.

Al día siguiente, prepare la muestra de microARN para la transfección diluyendo el microARN 143 y el microARN 506 en el medio, a una concentración de 100 nanomolares cada uno. Saque el matraz de la incubadora y retire el medio. Lavar con 1 x PBS.

Todos los controles no tratados contendrán solo medios incompletos con celdas. Incubar las células con medios de transfección durante seis horas en una incubadora. Después de seis horas, retire el medio y reemplácelo con 4 mililitros de medio completo nuevo. Recolectar las células a las 24 horas y a las 48 horas por tripsinización.

A continuación, lávese dos veces con 1x PBS en cada tubo y elimine el sobrenadante. Para realizar la extracción de ARN en un momento posterior, congele las células a menos 80 grados centígrados.

- La extracción de ARN se realizó con un kit de ARN, siguiendo las instrucciones del fabricante. Primero retire los tubos a menos 80 grados centígrados y deje que se descongelen.

- Añadir 300 microlitros de tampón de lisis y pipetear hacia arriba y hacia abajo para romper la membrana celular. Agregue el mismo volumen de etanol 100% ultra puro. Luego mezcle bien y colóquelo en la columna de separación. Centrifugar y eliminar el flujo a través.

Agregue 400 microlitros de tampón de lavado y centrifugar para eliminar el tampón. Añadir 5 microlitros de ADNasa I con 75 microlitros de tampón de digestión de ADN en cada muestra e incubar durante 15 minutos. A continuación, lave la muestra con tampón de preparación de ARN de 400 microlitros.

A continuación, lave dos veces con tampón de lavado de ARN. Ahora agregue agua sin nucleasas a la columna, centrifugue y luego recoja el ARN. Mida la concentración de ARN, en esta etapa, se pueden enviar 2 microgramos de muestra de ARN para la secuenciación de ARN.