Microarray de anticuerpos: una técnica para estudiar la expresión proteica de células de cáncer de pulmón tratadas con miRNA

- Comience agregando una solución de biotina y un tampón de etiquetado a la muestra de proteína. Incubar para facilitar la unión de la biotina a las proteínas. Agregue un reactivo de parada y un vórtice. A continuación, coloque un portaobjetos de microarrays de anticuerpos en una placa que contenga un reactivo de bloqueo para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Lave el portaobjetos con agua destilada doble para eliminar la solución de bloqueo. Coloque el portaobjetos de microarray en una cámara. Mezclar la muestra de proteína biotinilada con una solución de acoplamiento y añadirla al portaobjetos para facilitar la unión de las proteínas diana a sus anticuerpos correspondientes. Transfiera el portaobjetos a un plato que contenga un tampón de lavado y reemplace el tampón con agua destilada doble. A continuación, coloque el portaobjetos en un tampón de detección que contenga estreptavidina marcada con fluorescencia para promover su unión a las proteínas biotiniladas.

Incuba la placa en la oscuridad para mantener la intensidad de la fluorescencia. Retire el portaobjetos y colóquelo en un escáner de microarrays. El escáner busca señales fluorescentes de la estreptavidina unida a la proteína diana. En función de la intensidad de la fluorescencia, el software analiza el grado de expresión de la proteína. En el siguiente protocolo, realizamos un microarray de anticuerpos para analizar las alteraciones en la expresión génica asociadas al ciclo celular.

- Este experimento tiene como objetivo identificar todos los cambios en la expresión de las proteínas de la vía del ciclo celular mediante el tratamiento con microARN. Recoger muestras de proteínas de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección de transfección y cuantificar con el ensayo BCA. Retire los portaobjetos a menos 4 grados centígrados una hora antes del experimento para llevarlos a temperatura ambiente y eliminar la humedad. Tome 70 microgramos de muestras de proteínas y prepare los portaobjetos de muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que también se describen paso a paso en la sección de texto.

Aquí para tener en cuenta, el lavado adecuado de los portaobjetos con agua desionizada ultrapura es otro paso importante, ya que esto ayudará a reducir el fondo de los portaobjetos. Además, es muy importante en este experimento no secar los portaobjetos de muestra hasta el paso final. Finalmente, escanee el portaobjetos con una máquina de microarrays y analice los datos.