Ensayo de formación de colonias: evaluación de la eficacia de los agentes anticancerígenos en las células de cáncer de pulmón formadoras de colonias

- El ensayo de formación de colonias es un análisis in vitro de un fármaco contra el cáncer sobre el crecimiento de la célula cancerosa, que prolifera y se diferencia en colonias en medios semisólidos. Para empezar, siembre las células cancerosas en el medio RPMI con un suplemento de crecimiento: suero fetal bovino, o FBS, y antibiótico. Incubar las células durante el tiempo requerido.

A continuación, recoja la concentración deseada de células en un tubo de microfuga y una centrífuga. Vuelva a suspender el pellet en PBS. Prepare el medio a base de metilcelulosa y dispense a diferentes tubos con FBS para promover un crecimiento óptimo.

Agregue una cantidad apropiada de suspensión celular en tubos y vórtelos para mezclar las celdas con el medio. A continuación, agregue compuestos anticancerígenos en tubos y prepare un control agregando DMSO. Tubos de vórtice.

Agregue esta mezcla de células a la placa de cultivo e incube durante el tiempo deseado. Después de la incubación, agregue bromuro de metiltiazol difeniltetrazolio, o MTT, e incube durante algún tiempo. El MTT reduce la sal amarilla de tetrazolio en células viables a cristales de formazano púrpura. Las colonias viables se vuelven violetas. Capture las imágenes con una cámara digital y analice las colonias viables. En el siguiente protocolo, estudiaremos el ensayo de formación de colonias para evaluar la actividad de los miméticos de hidroxicumarina OT48 y BH3 en el cáncer de pulmón.

- Para empezar, coloque 20.000 células A549 por centímetro cuadrado en 15 mililitros de medio de cultivo celular RPMI 1640, suplementado con 10% de FBS y 1% de antibióticos en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de CO₂. El día del experimento, use un hemocitómetro para determinar la concentración celular.

Recoja 50.000 células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por centrifugación a 400 g durante siete minutos. Y vuelva a suspender las células en 100 microlitros de PBS estéril 1X. Con una pipeta múltiple, dispense 1,1 mililitros de medio semisólido a base de metilcelulosa, o MCBM, en tubos, preparando un tubo para cada condición. A continuación, añada 110 microlitros de FBS a cada tubo.

A continuación, siembra 1.000 células por mililitro. A continuación, pipetee 2,4 microlitros de la solución de pila madre en los tubos de MCBM y FBS. Después de agregar las celdas, sostenga los tubos verticalmente y vértice a la velocidad más alta durante un minuto para mezclar completamente el MCBM y las celdas.

Ahora, agregue el compuesto de prueba OT48 solo, o en combinación con A1210477, a las muestras. Prepare un tubo separado como control para el solvente utilizado, como DMSO. A continuación, agite las muestras durante un minuto.

Para cada ensayo, pipetee un mililitro de la mezcla en el pocillo central de una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Luego use un mililitro de agua estéril o PBS para llenar los pozos vacíos. Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de CO₂ durante 10 días. A continuación, añada 200 microlitros de una solución madre de MTT de cinco miligramos por mililitro a cada pocillo. Después de incubar las placas durante 10 minutos, verifique si hay colonias viables, que se volverán violetas.