Ensayo de inmunofluorescencia: un método para identificar células tumorales capturadas en un cable médico

0 vistas4:32 min • April 30th, 2023

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- Tome un alambre funcionalizado que tenga una pequeña porción de oro recubierta con un hidrogel junto con anticuerpos de interés. Sumerge la parte dorada del alambre en un frasco que contenga células tumorales. Ciérrelo con un tapón de alambre e incubelo en un rotador de tubos. Las células tumorales circulantes o CTC que muestran antígenos de superficie se unen a los anticuerpos en el alambre. Enjuague el alambre sumergiéndolo en viales que contengan solución salina tamponada con fosfato o PBS y séquelo al aire. Ahora sumerge el alambre en una solución de acetona para fijar las células deshidratándolas.

A continuación, inserte suavemente el cable a través de una punta P200 con la parte funcionalizada en su interior. Llene la cinta con un anticuerpo conjugado con un fluorocromo para sumergir el alambre. Estos anticuerpos marcados se unirán a sus respectivos antígenos presentes en las células. Selle la abertura con una película de laboratorio e incube durante la noche en la oscuridad a 4 grados centígrados. A continuación, lave el alambre con PBS para eliminar los anticuerpos no unidos. Coloque el cable en un soporte de cable y obsérvelo bajo un microscopio fluorescente. Las CTC unidas por anticuerpos emiten fluorescencia en el cable. En el siguiente protocolo, capturaremos las CTC en un cable médico y las identificaremos mediante tinción inmunofluorescente.

- Para comenzar el experimento, vuelva a suspender todo el contenido de un matraz T75 que esté al 80% de confluencia en un vial de 5 mililitros utilizando 4 mililitros de medio completo. A continuación, retire el alambre de su embalaje de vidrio. Sumerja la parte dorada funcionalizada del alambre en el vial asegurándose de que el tapón de alambre sea hermético para un vial de 5 mililitros. Selle el alambre con una película de laboratorio. Luego incube el alambre en un rotador de tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la rotación, enjuague el alambre tres veces en una solución de PBS de un pliegue usando tres viales limpios diferentes y espere a que el alambre se seque.

Después de secar el alambre al aire durante 10 minutos en una campana, fije las celdas sumergiendo el alambre en una solución de acetona al 100% en un tubo de 5 mililitros durante 10 minutos a temperatura ambiente. Asegúrese de que no haya rastros de acetona en la punta funcionalizada. Seque el alambre al aire durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, en un tubo de 5 mililitros, lave el alambre dos veces en un pliegue PBS. Incubar el alambre en tampón de dilución de anticuerpos.

Prepare 150 microlitros de mezcla de anticuerpos con una dilución de anticuerpo primario monoclonal conjugado con fluorocromo y tampón de dilución de anticuerpos como se especifica en la hoja de datos. A continuación, utilice una punta P200 para extraer el cable del tapón de cable e inserte suavemente el cable a través del orificio más grande de la punta. Inserte primero el extremo no funcionalizado y tire lentamente del alambre a través del orificio más pequeño hasta que la parte dorada esté justo más allá del orificio más grande. Agregue suavemente 150 microlitros de la mezcla de anticuerpos en la punta.

Para evitar el riesgo de formación de burbujas, gire suavemente el alambre hasta que el extremo funcionalizado esté completamente sumergido. Selle el orificio de la punta y envuelva la película de laboratorio alrededor del orificio. Incube el alambre verticalmente durante la noche en la oscuridad a 4 grados centígrados. Al segundo día, bloquee la incubación de anticuerpos lavando el alambre dos veces en un pliegue de PBS. Vuelva a insertar el cable en su tapón de alambre.

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Última actualización: 22 agosto 2026