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- Comience colocando una sección delgada de tejido en una solución de amoníaco para permitir una recuperación suave del antígeno. Transfiera la sección a un portaobjetos recubierto de polilisina. Las células cargadas negativamente se unen a la polilisina cargada positivamente. A continuación, agregue peróxido de hidrógeno para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Lave el portaobjetos con solución salina Tris-Buffered, TBS.
El TBS promueve el acceso de los anticuerpos a los antígenos mediante la ruptura de los enlaces cruzados de proteínas. Lave la sección con una solución de bloque para reducir la unión de anticuerpos inespecíficos. Agregue anticuerpos primarios a la sección e incube durante la noche. El anticuerpo primario se une a su antígeno específico presente en la superficie celular. Lave el portaobjetos con TBS.
Agregue anticuerpos secundarios conjugados con biotina que se unen a la región Fc del anticuerpo primario. Lave la sección con la enzima estreptavidina-biotina peroxidasa. A continuación, agregue sustrato cromogénico de peroxidasa al tejido. La peroxidasa convierte el cromógeno en un producto insoluble coloreado.
Contratinción del tejido con solución de hematoxilina. La hematoxilina se une a los componentes ácidos de las células y las vuelve azules. Observe el tejido bajo un microscopio óptico. Los antígenos se detectan en rojo, mientras que las células aparecen en azul debido a la hematoxilina. En el siguiente protocolo, realizaremos una tinción inmunohistoquímica para identificar las células CD45 y CD1a a partir de biopsias endobronquiales.
- Antes de seccionar el tejido de biopsia incrustado, ajuste cuidadosamente el portacuchillas en el ángulo del bloque de biopsia para que la cuchilla quede plana contra la superficie del bloque. A continuación, corte lentamente al menos dos secciones de 2 micras de grosor de cada muestra de biopsia endobronquial, utilizando fórceps para transferir cada corte de tejido recién cortado a una solución de amoníaco y agua destilada al 0,05%. Después de 45 a 90 segundos, use un portaobjetos de microscopio recubierto de poli-L-lisina para recoger cada sección desplegada y dejar que las secciones se sequen durante al menos una hora.
Cuando las secciones se hayan secado, etiquete los portaobjetos según corresponda para el experimento y dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de cada muestra. A continuación, aplique 1 mililitro de solución de bloque de peroxidasa recién preparada en las secciones. Después de 30 minutos, retire la solución de bloqueo de peroxidasa y luego lave las secciones tres veces durante cinco minutos con TBS, luego retire el TBS y agregue una solución de bloqueo de BSA al 1% para otra incubación de 30 minutos para bloquear cualquier unión de anticuerpos no específicos.
Al final de la incubación, agregue el anticuerpo primario de interés, diluido en TBS, y cubra el cubrimiento de las muestras para una incubación nocturna a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces en TBS y aplique el anticuerpo secundario de interés durante dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces más en TBS fresco e incube las muestras en una solución compleja de estreptavidina-biotina peroxidasa recién preparada durante dos horas a temperatura ambiente, seguidas de tres lavados más con TBS.
A continuación, trate los platos con una solución de sustrato de peroxidasa AEC recién preparada durante 20 a 30 minutos. Cuando se desarrolle la intensidad de tinción deseada, enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo durante cinco minutos y contratiña las secciones con una solución de hematoxilina de Mayer filtrada. Después de dos minutos, lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante otros cinco minutos, luego drene los portaobjetos y cubra las secciones con medio de montaje acuoso permanente, secando las muestras en un horno de secado a 80 grados centígrados.
Una vez que se hayan enfriado, monte las muestras con un medio de montaje DPX y un cubreobjetos para su análisis con un aumento de 40 veces en un microscopio óptico.