Aislamiento de exosomas: una técnica para separar exosomas del plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas

0 vistas4:21 min • April 30th, 2023

- Los exosomas son pequeñas vesículas unidas a la membrana que transportan biomoléculas como lípidos, proteínas, ADN, ARNm y microARN. Los exosomas son liberados por diferentes tipos de células en espacios extracelulares y pueden aislarse de biofluidos como el plasma.

Para comenzar, centrifuga la muestra de plasma para eliminar las células y los desechos. Transfiera el sobrenadante de plasma a un tubo nuevo. Tratar el plasma con la concentración deseada de la enzima ribonucleasa. Incubar la muestra en un bloque calefactor a 37 grados centígrados durante un tiempo adecuado.

La enzima degrada cualquier ARN libre en la muestra, mientras que el ARN exosomal permanece protegido. Diluir la muestra con PBS. A continuación, agregue la concentración deseada de solución de enzima proteinasa K e incube a 37 grados centígrados durante un tiempo adecuado. La proteinasa K degrada la mayor parte de las proteínas plasmáticas. También inactiva la enzima ribonucleasa previamente añadida, eliminando así el riesgo de degradación del ARN exosomal durante el procesamiento posterior.

Añadir un volumen adecuado de tampón de precipitación de exosomas para facilitar la separación de los exosomas del plasma. Centrifugar la muestra para obtener un pellet que contenga exosomas intactos. Los exosomas aislados encuentran aplicaciones en pasos posteriores como extracciones de ARN y proteínas.

En el siguiente protocolo, realizaremos el aislamiento de exosomas a partir de la muestra de plasma de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico.

- Para empezar, descongela una muestra de plasma de 1 mililitro con hielo. Una vez descongelado, invierta el tubo varias veces para desagregar los crioprecipitados que se hayan formado. A continuación, centrifugar el plasma a 2.000 Gs durante 20 minutos a temperatura ambiente, con el fin de eliminar las células y los residuos. Recoja el sobrenadante y centrifugue el plasma de nuevo, ahora a 10.000 Gs durante 20 minutos. De nuevo, recoge el sobrenadante de plasma y ahora añade 10 microlitros de ARNasa. Incubar el plasma a 37 grados centígrados durante 10 minutos en un calentador de bloque térmico.

- Añadimos un paso de tratamiento con ARNasa al protocolo estándar del kit para degradar los microARN libres. Posteriormente, se aprovechó la etapa de tratamiento con proteinasa K, incluida en el protocolo del kit, con el fin de degradar la ARNasa y proteger la integridad de los microARN exosomales.

- A continuación, transfiera el plasma a un nuevo tubo a medio volumen de 1x PBS y haga un vórtice. A continuación, se añaden 0,05 volúmenes de solución de proteinasa K, se vuelve a vorexear la muestra y se incuba a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Ahora, agregue 0,2 volúmenes de tampón de precipitación de exosomas y mezcle la muestra por inversión. Luego, incube la muestra a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.

Después de la incubación en frío, centrifugar la muestra a 10.000 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tome una alícuota de 20 a 50 microlitros del sobrenadante y guárdela con fines de control. A continuación, aspire y deseche el sobrenadante restante.

Vuelva a suspender el gránulo de exosoma en el tampón de elección, a un volumen que dependerá del análisis posterior. Para el análisis de ARN, agregue un tampón de lisis específico para la extracción de ARN.

09:48

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Videos relacionados

0 Vistas

09:22

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Videos relacionados

0 Vistas

09:30

Usando dispersión mejorada por Nanoplasmon y imágenes de microscopio de baja magnificación para cuantificar exosomas derivados del tumor

Videos relacionados

0 Vistas

04:03

Extracción de exosomas basada en perlas magnéticas: una técnica para aislar exosomas específicos de biofluidos

Videos relacionados

0 Vistas

11:38

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

Videos relacionados

0 Vistas

06:46

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Videos relacionados

0 Vistas

08:49

Análisis miARN exosomal en células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) de plasma de los pacientes a través de qPCR: una herramienta de biopsia líquida factible

Videos relacionados

0 Vistas

06:59

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Videos relacionados

0 Vistas

09:59

Preparación de exosomas siRNA entrega a las células cancerosas

Videos relacionados

0 Vistas

09:03

Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

Videos relacionados

0 Vistas

Última actualización: 29 agosto 2026