Preservación de tejidos embebidos en parafina fijada en formol (FFPE): un método para estudiar la morfología de los tejidos
JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 4:17 min • April 30th, 2023
- Primero, coloque una rebanada de pañuelo sobre un papel de filtro empapado con PBS para evitar la contracción o hinchazón de las células equilibrando la osmolaridad. Transfiera el pañuelo a un casete de histo. Cierre y coloque el casete en una solución de formol neutro tamponado, NBF. El NBF contiene formaldehído que se une a los grupos de aminoácidos y evita la formación de ácido fórmico que pigmenta el tejido. Deje el casete toda la noche a baja temperatura, lo que evita la degradación del ácido nucleico y fija el tejido. Deshidrata el tejido con múltiples lavados con alcohol.
Colócalo en parafina líquida y presiónalo hasta el fondo del molde. Retire el peso y coloque la parte inferior del casete histo sobre el pañuelo. Vierta parafina líquida sobre el conjunto. Deje que la configuración se solidifique en una placa fría. La parafina es insoluble en agua y, después de entrar en el tejido deshidratado, se endurece y ayuda a seccionar. Transfiera el bloque de tejido en un micrótomo. Corta y recoge secciones delgadas del tejido en un portaobjetos. Si la sección es demasiado gruesa, el oxígeno y otros nutrientes no pueden difundirse a través de la rebanada, creando un falso gradiente de necrosis. Si la sección es demasiado delgada, tiende a curvarse. El video del protocolo examina la expresión de biomarcadores y la viabilidad celular de los tejidos FFPE del cáncer de pulmón.
- Para comenzar a fijar la rebanada deseada, transfiérala con cuidado con pinzas a una placa de 10 centímetros que contenga un papel de filtro empapado lleno de 2 a 3 mililitros de PBS y déjelo flotar. A continuación, levanta el papel de filtro con un par de pinzas y colócalo en un casete de histo. Transfiera el papel de filtro a un casete histórico. Agregue una gota de hematoxilina diluida encima de la rebanada de tejido para marcar la posición de la rebanada para los pasos siguientes. Cierre el casete y transfiéralo a una solución de formalina tamponada neutra al 4% y déjelo toda la noche a 4 grados centígrados. Después de lavar y procesar el casete como se describe en el protocolo, abra el casete histo y use un bisturí para levantar con cuidado la rebanada fija del papel de filtro. Deseche el papel de filtro y transfiera la rebanada a un molde que contenga parafina líquida.
Use un peso plano para presionar el tejido contra la parte inferior del molde de inclusión para asegurar una sección uniforme. Coloque la parte inferior del casete histo encima del molde, agregue parafina líquida encima y deje enfriar el molde en una placa fría durante 30 minutos. Después de eso, separe el molde enfriado del bloque de parafina. Utilice un micrótomo para preparar secciones delgadas de 4 micrómetros de los bloques de cortes de tejido FFPE. Elimina el exceso de parafina que rodea el tejido. Para obtener secciones uniformes en todo el tejido, ajuste el ángulo del bloque de modo que la superficie del bloque esté orientada horizontalmente con respecto a la hoja. Con un cepillo fino, recoja secciones secuenciales de tejido de la rebanada de tejido incrustado en parafina, comenzando en la parte superior de los portaobjetos de vidrio. Continúe recogiendo las secciones de las capas de tejido más profundas hasta el medio, seguidas de la parte inferior de los portaobjetos de vidrio.
- La recolección de secciones de diferentes capas de cada corte de tejido a los portaobjetos se realiza para permitir la captura de posibles gradientes inducidos por el cultivo en la viabilidad, la migración celular o la expresión de biomarcadores.
- Después de recopilar las secciones, continúe con su procesamiento y análisis posterior como se describe en el protocolo.
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para preparar cortes de tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) para su análisis. El método asegura una fijación y corte adecuados para mantener la integridad del tejido y facilitar estudios sobre la expresión de biomarcadores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Histología
- Procesamiento de tejidos
Antecedentes
- FFPE es un método común para la conservación de muestras de tejido.
- La fijación adecuada previene la degradación de los ácidos nucleicos.
- El grosor de las secciones es fundamental para un análisis preciso.
- La expresión de biomarcadores puede verse influenciada por los métodos de procesamiento del tejido.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para la preparación de cortes de tejido incluidos en parafina (FFPE).
- Asegurar condiciones óptimas para el análisis de biomarcadores.
- Destacar la importancia del espesor de la sección en estudios histológicos.
Métodos Utilizados
- Fijación de cortes de tejido en formalina tamponada neutra.
- Inclusión en parafina líquida para el corte.
- Uso de un microtomo para cortar secciones delgadas.
- Recopilación de secciones para el análisis de viabilidad y expresión de biomarcadores.
Resultados principales
- Preservación exitosa de la morfología del tejido.
- Capacidad para analizar la expresión de biomarcadores a partir de muestras en FFPE.
- Demuestra los efectos del grosor de las secciones sobre el análisis.
- Información sobre posibles gradientes inducidos por el cultivo en muestras de tejido.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método robusto para la preparación de tejidos FFPE.
- Las técnicas adecuadas mejoran la fiabilidad de los análisis histológicos.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para diversos tipos de tejidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preparación de tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) permite una conservación confiable de la morfología tisular para el análisis de biomarcadores en flujos de trabajo de oncología e histología. Este método favorece un corte consistente y la integridad estructural, aspectos críticos para un perfilado inmunohistoquímico y molecular preciso en modelos preclínicos de cáncer. Al minimizar los artefactos derivados de una fijación o corte inadecuados, el FFPE mejora la reproducibilidad de los datos y la confianza en los estudios de validación de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la arquitectura tisular conservada y la localización de biomarcadores.
- Valor operativo: Proporciona un enfoque estandarizado para estabilizar muestras de tejido para análisis longitudinales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera secciones de tejido uniformes adecuadas para la tinción inmunohistoquímica y la evaluación cuantitativa de biomarcadores.
- Valor operativo: Asegura la consistencia en el grosor de las secciones, lo cual es esencial para una detección de señal confiable y la estandarización de ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la antigenicidad y el contexto estructural para evaluar la expresión del blanco en modelos relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Permite el biobanco de muestras preclínicas para análisis retrospectivo y comparación entre estudios.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La preparación de tejidos FFPE se integra en el continuo de descubrimiento al permitir la preservación confiable de muestras desde la caracterización inicial del modelo hasta las etapas de validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al preservar las relaciones espaciales de los biomarcadores y los fenotipos celulares en cortes de tejido.
- Cribado: Proporciona secciones delgadas y reproducibles que permiten una penetración constante de los anticuerpos y una cuantificación fiable de la señal en ensayos de cribado.
- Análisis: Produce secciones adecuadas para el análisis cuantitativo de imágenes y el perfilado multiplex de biomarcadores.
- Investigación Traducional: Permite mantener la continuidad desde modelos in vitro o de explantes hasta el análisis de tejidos archivados para la validación de la expresión de dianas.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad escalable y estandarizada de procesamiento de tejidos aplicable a múltiples proyectos de oncología y sistemas modelo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al reducir los artefactos morfológicos y preservar la integridad de los epítopos para una puntuación precisa de biomarcadores.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante parámetros estandarizados de fijación, deshidratación e inclusión.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en la selección de objetivos al garantizar la calidad de los datos procedentes de modelos de tejidos preclínicos.
- Impacto en la cartera: Apoya la toma de decisiones ajustadas al riesgo al proporcionar datos histológicos confiables para criterios de avance o interrupción en el desarrollo de objetivos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histopatología para optimizar los tiempos de fijación y la orientación del incluido.
- Depende del acceso a micrótomos, estaciones de inclusión en parafina y placas frías para obtener cortes consistentes.
- Necesita protocolos estandarizados entre los equipos para garantizar la uniformidad del grosor de los cortes y la consistencia de la tinción.
- Debe tener en cuenta la variabilidad del tipo de tejido en la infiltración con parafina y el comportamiento durante el corte.
- Está limitado por el posible enmascaramiento de antígenos tras almacenamiento prolongado, lo que requiere validación para cada biomarcador y condición de almacenamiento.
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Última actualización: 22 agosto 2026