Preservación de tejidos embebidos en parafina fijada en formol (FFPE): un método para estudiar la morfología de los tejidos

- Primero, coloque una rebanada de pañuelo sobre un papel de filtro empapado con PBS para evitar la contracción o hinchazón de las células equilibrando la osmolaridad. Transfiera el pañuelo a un casete de histo. Cierre y coloque el casete en una solución de formol neutro tamponado, NBF. El NBF contiene formaldehído que se une a los grupos de aminoácidos y evita la formación de ácido fórmico que pigmenta el tejido. Deje el casete toda la noche a baja temperatura, lo que evita la degradación del ácido nucleico y fija el tejido. Deshidrata el tejido con múltiples lavados con alcohol.

Colócalo en parafina líquida y presiónalo hasta el fondo del molde. Retire el peso y coloque la parte inferior del casete histo sobre el pañuelo. Vierta parafina líquida sobre el conjunto. Deje que la configuración se solidifique en una placa fría. La parafina es insoluble en agua y, después de entrar en el tejido deshidratado, se endurece y ayuda a seccionar. Transfiera el bloque de tejido en un micrótomo. Corta y recoge secciones delgadas del tejido en un portaobjetos. Si la sección es demasiado gruesa, el oxígeno y otros nutrientes no pueden difundirse a través de la rebanada, creando un falso gradiente de necrosis. Si la sección es demasiado delgada, tiende a curvarse. El video del protocolo examina la expresión de biomarcadores y la viabilidad celular de los tejidos FFPE del cáncer de pulmón.

- Para comenzar a fijar la rebanada deseada, transfiérala con cuidado con pinzas a una placa de 10 centímetros que contenga un papel de filtro empapado lleno de 2 a 3 mililitros de PBS y déjelo flotar. A continuación, levanta el papel de filtro con un par de pinzas y colócalo en un casete de histo. Transfiera el papel de filtro a un casete histórico. Agregue una gota de hematoxilina diluida encima de la rebanada de tejido para marcar la posición de la rebanada para los pasos siguientes. Cierre el casete y transfiéralo a una solución de formalina tamponada neutra al 4% y déjelo toda la noche a 4 grados centígrados. Después de lavar y procesar el casete como se describe en el protocolo, abra el casete histo y use un bisturí para levantar con cuidado la rebanada fija del papel de filtro. Deseche el papel de filtro y transfiera la rebanada a un molde que contenga parafina líquida.

Use un peso plano para presionar el tejido contra la parte inferior del molde de inclusión para asegurar una sección uniforme. Coloque la parte inferior del casete histo encima del molde, agregue parafina líquida encima y deje enfriar el molde en una placa fría durante 30 minutos. Después de eso, separe el molde enfriado del bloque de parafina. Utilice un micrótomo para preparar secciones delgadas de 4 micrómetros de los bloques de cortes de tejido FFPE. Elimina el exceso de parafina que rodea el tejido. Para obtener secciones uniformes en todo el tejido, ajuste el ángulo del bloque de modo que la superficie del bloque esté orientada horizontalmente con respecto a la hoja. Con un cepillo fino, recoja secciones secuenciales de tejido de la rebanada de tejido incrustado en parafina, comenzando en la parte superior de los portaobjetos de vidrio. Continúe recogiendo las secciones de las capas de tejido más profundas hasta el medio, seguidas de la parte inferior de los portaobjetos de vidrio.

- La recolección de secciones de diferentes capas de cada corte de tejido a los portaobjetos se realiza para permitir la captura de posibles gradientes inducidos por el cultivo en la viabilidad, la migración celular o la expresión de biomarcadores.

- Después de recopilar las secciones, continúe con su procesamiento y análisis posterior como se describe en el protocolo.