Comparativo In vivo Estudio de la gp96 adyuvante de la rana Xenopus laevis

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la capacidad de conservación evolutiva de la proteína de choque térmico G 96 para promover las respuestas de las células T CD ocho específicas del antígeno en las mangas de la rana xenopus. Esto se logra mediante la recolección inicial de leucocitos peritoneales mediante lavado peritoneal. El segundo paso del procedimiento es pulsar los leucocitos peritoneales con GP 96 derivado del tumor que acompaña a los antígenos menores y tumorales después de la incubación y los lavados.

Los leucocitos peritoneales se transfieren adoptivamente por inyección intraperitoneal a ranas naïve con el fin de preparar a estas ranas contra antígenos tumorales o de histocompatibilidad menor. El tercer paso del procedimiento es desafiar con el injerto de piel o el tumor a las ranas cebadas y monitorear el inicio del injerto de piel, el rechazo o la aparición del tumor. El paso final del procedimiento es obtener sangre periférica para caracterizar las células T involucradas en el rechazo de la piel y las respuestas antitumorales.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una aceleración significativa del rechazo del injerto de piel, así como retrasos en la aparición del tumor en ranas preparadas con GP 96 a través de los ensayos de injerto de piel y de provocación tumoral, respectivamente. Hola, soy Christina Koska en el laboratorio del Dr. Jacque Robert en el Departamento de Microbiología e Inmunología del Centro Médico de la Universidad de Rochester. Soy Tanya Cruz, también del laboratorio del Dr. River.

Hoy le mostraremos un procedimiento para cebar ranas clonadas mediante transferencia adoptiva de leucocitos peritoneales, seguido de ensayos de injerto de piel y trasplante de tumores. Además, también te mostraremos cómo obtener sangre periférica de estos animales. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la capacidad de calentar la proteína GP 96 para promover células CDAT específicas de antígeno en Salla, así como para estudiar los tipos de células involucradas.

Bien, comencemos. Las ranas utilizadas en nuestros experimentos son clones genéticos ISO de nuestra colonia de cría en la Universidad de Rochester. Para obtener leucocitos peritoneales o pls para la recolección, use una aguja de calibre 25 five eight para inyectar la rana anestesiada intraperitoneal con una preparación de e-coli muerta por calor Tres días después de la inyección, los pls se recolectan mediante lavado intraperitoneal.

Para comenzar este procedimiento, desinfecte el abdomen de la rana anestesiada con una pequeña cantidad de etanol al 70%. A continuación, utilice una aguja de calibre 18 1,5 para inyectar cinco mililitros de solución salina estéril tamponada con fosfato de anfibio, o un PBS de preguerra a temperatura ambiente en la cavidad peritoneal. Retire la aguja y masajee suavemente la rana durante un minuto para asegurarse de que el tampón inyectado se iguale con el líquido de la cavidad corporal.

A continuación, inserte una nueva aguja 1.5 de calibre 18 sin jeringa en el abdomen de la rana. Mientras evita los vasos sanguíneos, recoja el líquido peritoneal que goteará de la parte posterior de la aguja en un tubo cónico limpio de 50 mililitros. Asegúrese de recuperar la mayor cantidad posible del volumen inicial inyectado después de que se hayan cosechado.

Coloque a la rana en un recipiente con agua poco profunda hasta que esté despierta, momento en el que se puede volver a colocar en su jaula. Una vez que se hayan cosechado los pls, centrifugar a 1000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, eliminar el sup, el natante y resus. Suspenda los pls en frío A PBS.

Transfiera los pls RESUSPENDIDOS a un tubo de micro basura de 1,5 mililitros. Para pulsar el PLS con GP 96. Agregue la cantidad adecuada de GP 96 a los pls y mezcle pipeteando la incubación en hielo durante una hora después de una hora.

Centrifugar las celdas a 14.000 rpm durante un minuto. Para eliminar cualquier GP 96 no unido, retire el sobrenadante. Agregue frío A PBS y resus.

Vuelva a suspender la centrífuga PLS. Lave el S con A-P-B-S-A con agua fría un total de tres veces para asegurarse de que no queden residuos de G 96 después del lavado final. Resus suspende los pls pulsados a una concentración de cinco veces 10 a los cinco pls por 300 microlitros de un PBS para transferir adoptivamente los pls a los ingenuos receptores LG seis.

Inyectar intraperitonealmente 300 microlitros de pls pulsados por animal. Las ranas deben prepararse al menos tres días antes de los experimentos de injerto de piel o desafío tumoral, que se mostrarán a continuación. La piel para el injerto se obtiene de una rana donante LG 15 anestesiada.

Use unas tijeras para cortar y quitar un pequeño trozo de piel ventral, que es la piel abdominal que parece plateada. Debido a la presencia de ARI, cuatro células pigmentadas mientras se manipulaba el injerto. Es crucial tener la menor manipulación posible del tejido, ya que eso causará daño al injerto.

Sujete la piel muy suavemente con las pinzas y colóquela en una placa de Petri que contenga A PBS frío. Mantén la placa de Petri encendida. Coloque la piel en un portaobjetos de vidrio nuevo y use una navaja para cortar los injertos individuales en piezas de cinco milímetros por cinco milímetros.

Mantenga los fragmentos en un PBS en hielo para injertar la piel en la rana receptora de LG six. En primer lugar, se realiza una pequeña incisión en la piel dorsal del receptor anestesiado. Luego inserte el injerto de cinco milímetros por cinco milímetros debajo de la piel con el lado plateado hacia arriba.

Asegúrese de anotar las marcas de tijera y pinza en los injertos porque no se cuentan como rechazo del injerto. Una vez que comienza el marcado 24 horas después, es necesario extraer una parte de la piel del huésped superpuesto del injerto. Use unas tijeras para cortar una ventana alrededor del injerto para que el injerto se pueda visualizar libremente.

Tenga cuidado de no tocar la piel del donante ni de inducir el sangrado. Comience a marcar el injerto de inmediato tomando un boceto. Injerto de piel.

El rechazo está determinado por el porcentaje de destrucción del aridol en la piel injertada. El injerto debe examinarse cada dos o tres días bajo el microscopio estereoscópico. Preparar las células tumorales para el trasplante por resus, suspendiéndolas en medio de cultivo tumoral a una densidad de cinco veces 10 a las cinco células por 300 microlitros.

Trasplante de las células mediante inyección subcutánea en un lado de la cara dorsal del animal. Se inyectan cinco veces 10 a las cinco células en un volumen de 300 microlitros por rana. El crecimiento del tumor comenzará dentro de dos o tres semanas después de la exposición del tumor.

Fíjate en el aspecto inicial del tumor. Use calibradores para medir las dimensiones del tumor y registrar su volumen cada dos o tres días antes de la recolección de leucocitos sanguíneos de la rana. Prepare agujas de vidrio tirando de los peppes de pasta sobre una llama.

Después de afilar la extremidad fina de la pipeta bajo el microscopio estereoscópico, conecte la pipeta a un tubo de plástico de aspiración. Para comenzar la recolección de sangre, corte la piel por encima de la pata posterior de la rana anestesiada para exponer la vena dorsal del tarso. Llene la aguja de vidrio con uno o dos mililitros de solución helada de A PBS más heparina.

A continuación, inserte la aguja de vidrio en la vena y comience a recoger sangre aspirando lentamente con la boca. Se pueden obtener de uno a dos mililitros de sangre de una rana de tamaño promedio. No es necesario coser la pequeña incisión en la pata de rana.

La herida sanará en una semana. Aquí se muestran los resultados de un análisis microscópico estereoscópico del rechazo del injerto de piel 12 días después del trasplante. Una rana clonada de LG Six que recibió un injerto de piel de un donante idéntico a LG Six MHC no mostró rechazo.

El asterisco indica que las pinzas marcadoras no se deben a rechazo. En contraste, una rana clonada de LG Six que recibió un injerto de piel de un donante endogámico dispar MHC muestra un rechazo del 80%. En ambas imágenes, las flechas indican cuatro células pigmentadas de color irido plateado que marcan tejido injertado sano no rechazado.

En este siguiente experimento, se pulsaron LG 15 pls con un PBS como control negativo, se monitorizaron las células recombinantes GP 96 purificadas a partir de un cultivo de E. coli o GP 96 purificadas a partir de 15 células de tejido tumoral cero, luego se transfirieron adoptivamente a receptores adultos LG 15 y tres días después, se trasplantaron 15 células tumorales vivas cero mediante inyección subcutánea. Se monitorizaron los tumores que aparecieron por primera vez días después del desafío, y se midió periódicamente el tamaño del tumor en En estos gráficos, cada curva representa la cinética del crecimiento tumoral en una rana. Los resultados muestran que los animales cebados con 0,5 o un microgramo de GP 96 tuvieron un retraso significativo en la aparición del tumor en comparación con los grupos de control. Por lo tanto, GP 96 facilita la presentación cruzada de antígenos tumorales en xenopus.

Así que acabamos de mostrarle cómo explorar la capacidad de GP 96 para representar antígenos menores y tumorales en la rana xap lavis mediante ensayos de injerto de piel y trasplante tumoral. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que se debe evitar recoger el lavado peritoneal si un vaso sanguíneo ha sido dañado, ya que la mayoría de las células se encuentran dentro de los eritrocitos y no los macrófagos. También es importante evitar apretar el tejido con las pinzas al manipular el injerto de piel para evitar daños.

Así que eso es todo. Gracias por lavarte y buena suerte con tus experimentos.