Comparativo In vivo Estudio de la gp96 adyuvante de la rana Xenopus laevis

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la conservación evolutiva de la proteína de choque térmico G 96 para promover respuestas de linfocitos T CD8 específicas contra antígenos en la rana Xenopus laevis. Esto se logra primero mediante la obtención de leucocitos peritoneales mediante lavado peritoneal. El segundo paso del procedimiento consiste en pulsar los leucocitos peritoneales con GP 96 derivada de tumor, que actúa como chaperona de antígenos menores y antígenos tumorales, tras incubación y lavados.

Los leucocitos peritoneales se transfieren adoptivamente mediante inyección intraperitoneal a ranas no inmunizadas para sensibilizar a estas ranas frente a antígenos tumorales o de histocompatibilidad menor. El tercer paso del procedimiento consiste en realizar un injerto de piel o una exposición al tumor en las ranas sensibilizadas y monitorear la aparición del injerto de piel, el rechazo o la aparición del tumor. El paso final del procedimiento es obtener sangre periférica para caracterizar las células T implicadas en las respuestas de rechazo de injerto cutáneo y antitumorales.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una aceleración significativa del rechazo del injerto de piel, así como retrasos en la aparición del tumor en ranas previamente sensibilizadas con GP 96, mediante los ensayos de injerto de piel y de desafío tumoral, respectivamente. Hola, soy Christina Koska en el laboratorio de la Dra. Jacque Robert, del Departamento de Microbiología e Inmunología del Centro Médico de la Universidad de Rochester. Soy Tanya Cruz, también del laboratorio de la Dra. River.

Hoy les mostraremos un procedimiento para sensibilizar ranas clonadas mediante la transferencia adoptiva de leucocitos peritoneales, seguido de ensayos de injertos de piel y trasplantes de tumores. Además, también les mostraremos cómo obtener sangre periférica de estos animales. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la capacidad de la proteína de choque térmico GP96 para promover células CD8+ específicas para antígenos en Salla, así como para estudiar los tipos celulares involucrados.

Vale, comencemos. Las ranas utilizadas en nuestros experimentos son clones genéticos ISO procedentes de nuestra colonia de cría en la Universidad de Rochester. Para inducir leucocitos peritoneales o LPS para su recolección, utilice una aguja de calibre 25 de cinco octavos para inyectar por vía intraperitoneal en la rana anestesiada una preparación de *E. coli* muerta por calor. Tres días después de la inyección, los LPS se recolectan mediante lavado intraperitoneal.

Para comenzar este procedimiento, desinfecte el abdomen de la rana anestesiada con una pequeña cantidad de etanol al 70 %. Luego, utilice una aguja de calibre 18 de 1,5 para inyectar cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato estéril para anfibios, o PBS previamente equilibrado a temperatura ambiente, en la cavidad peritoneal. Retire la aguja y masajee suavemente la rana durante un minuto para asegurar que el tampón inyectado se equilibre con el líquido presente en la cavidad corporal.

A continuación, inserte una nueva aguja de calibre 18 y 1,5 sin jeringa en el abdomen de la rana. Mientras evita los vasos sanguíneos, recoja el líquido peritoneal que gotee desde la parte posterior de la aguja hacia un tubo cónico limpio de 50 mililitros. Asegúrese de recuperar tanto como sea posible del volumen inicial inyectado después de haber cosechado las plaquetas.

Coloque la rana en un recipiente con agua poco profunda hasta que despierte, momento en el cual puede devolverse a su jaula. Una vez que se hayan recolectado los pls, centrifugue a 1000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, retire el sobrenadante y resuspenda. Suspender los pls en PBS A frío.

Transfiera el pls RESUSPENDIDO a un tubo microfugaz de 1,5 mililitros. Para pulsar el PLS con GP 96, agregue la cantidad adecuada de GP 96 al pls y mezcle mediante pipeteo. Incube en hielo durante una hora tras transcurrida una hora.

Centrifugar las células a 14.000 RPM durante un minuto. Para eliminar cualquier GP 96 no ligado, eliminar el sobrenadante. Añadir PBS A frío y resuspender.

Suspenda nuevamente el PLS en la centrífuga. Lave el S con A-P-B-S-A frío un total de tres veces para asegurar que no quede G 96 residual después del lavado final. Resuspenda los PLS pulsados a una concentración de cinco por 10 a la cinco PLS por 300 microlitros de PBS para transferir adoptivamente los PLS a seis receptores LG ingenuos.

Inyecte por vía intraperitoneal 300 microlitros de pls pulsados por animal. Las ranas deben ser sensibilizadas al menos tres días antes de los experimentos de injerto de piel o desafío con tumor, que se mostrarán a continuación. La piel para el injerto se obtiene de una rana donante LG 15 anestesiada.

Utilice tijeras para cortar y retirar un pequeño trozo de piel ventral, que es la piel abdominal que presenta un aspecto plateado. Debido a la presencia de cuatro células pigmentadas ARI al manipular el injerto. Es fundamental manipular el tejido lo menos posible, ya que esto podría causar daño al injerto.

Sujete la piel muy suavemente con la pinza y colóquela en una placa de Petri que contenga PBS A frío. Mantenga la placa de Petri encendida. Coloque la piel sobre un portaobjetos nuevo y utilice una cuchilla para cortar injertos individuales en trozos de cinco milímetros por cinco milímetros.

Mantenga los fragmentos en PBS sobre hielo para injertar la piel en la rana receptora LG seis. Primero, realice una pequeña incisión en la piel dorsal de la rana receptora anestesiada. Luego, inserte el injerto de cinco milímetros por cinco milímetros bajo la piel con el lado plateado hacia arriba.

Asegúrese de anotar las marcas de tijeras y pinzas en los injertos, ya que estas no se consideran rechazo del injerto. Una vez que comience la puntuación 24 horas después, es necesario eliminar una parte de la piel del huésped superpuesta al injerto. Utilice tijeras para recortar una ventana alrededor del injerto, de modo que este pueda visualizarse libremente.

Tenga cuidado de no tocar la piel del donante ni provocar sangrado. Comience a puntuar inmediatamente el injerto realizando un esquema. Injerto de piel.

El rechazo se determina por el porcentaje de destrucción del arildol en la piel injertada. El injerto debe revisarse cada dos o tres días bajo el microscopio estereoscópico. Prepare las células tumorales para trasplante mediante resuspensión, suspendiéndolas en medio de cultivo tumoral a una densidad de cinco por 10 a la cinco células por 300 microlitros.

Transplante las células mediante inyección subcutánea en un lado de la región dorsal del animal. Se inyectan cinco veces 10 a la cinco células en un volumen de 300 microlitros por rana. El crecimiento tumoral comenzará dentro de las dos a tres semanas posteriores al desafío tumoral.

Observe la apariencia inicial del tumor. Utilice un calibrador para medir las dimensiones del tumor y registre su volumen cada dos o tres días antes de la recolección de leucocitos sanguíneos de la rana. Prepare agujas de vidrio estirando pastas de pipetas sobre una llama.

Después de afilar el extremo fino de la pipeta bajo el microscopio estereoscópico, conecte la pipeta a un tubo plástico de aspiración. Para comenzar la recolección de sangre, corte la piel por encima del pie posterior de la rana anestesiada para exponer la vena tarsal dorsal. Llene la aguja de vidrio con uno a dos mililitros de solución fría de PBS A más heparina.

Luego, inserte la aguja de vidrio en la vena e inicie la recolección de sangre aspirando lentamente con la boca. Se puede obtener de uno a dos mililitros de sangre de una rana de tamaño promedio. La pequeña incisión en la pata de la rana no necesita ser cosida.

La herida sanará dentro de una semana. Aquí se muestran los resultados de un análisis mediante microscopía estereoscópica del rechazo de injertos cutáneos 12 días después del trasplante. Una rana LG seis clonada que recibió un injerto de piel de un donante LG seis idéntico en el MHC no mostró rechazo.

El asterisco indica la pinza marcadora no debida al rechazo. En contraste, una rana clonada LG6 que recibió un injerto de piel de un donante cruzado genéticamente distinto en el MHC muestra un 80 % de rechazo. En ambas imágenes, las flechas indican células pigmentadas iridiscentes plateadas que marcan tejido injertado sano no rechazado.

En este siguiente experimento, se estimularon LG 15 plc con PBS como control negativo, GP 96 recombinante purificado de un cultivo de e coli o GP 96 purificado de células de tejido tumoral 15 cero. Luego, estas células se transfirieron adoptivamente a receptores adultos LG 15, y tres días después se trasplantaron células tumorales 15 cero viables mediante inyección subcutánea. Los tumores que aparecieron primero tras el desafío fueron monitoreados, y el tamaño tumoral se midió periódicamente. En estos gráficos, cada curva representa la cinética del crecimiento tumoral en una rana. Los resultados muestran que los animales sensibilizados con 0,5 o un microgramo de GP 96 presentaron un retraso significativo en la aparición del tumor en comparación con los grupos control. Por lo tanto, GP 96 facilita la presentación cruzada de antígenos tumorales en xenopus.

Así que acabamos de mostrarle cómo explorar la capacidad de la GP 96 para presentar tanto antígenos menores como antígenos tumorales en la rana Xenopus laevis mediante ensayos de trasplante de piel y trasplante de tumores. Al realizar este procedimiento, es importante recordar evitar recolectar el lavado peritoneal si se ha dañado un vaso sanguíneo, ya que la mayoría de las células serían eritrocitos y no macrófagos. También es fundamental evitar apretar el tejido con la pinza al manipular el injerto de piel para prevenir daños.

Así que eso es todo. Gracias por lavar y mucha suerte con sus experimentos.