Name: ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-02T17:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Aprende a identificar microorganismos activos mediante sondeo de isótopos estables en ADN sin necesidad de cultivo. Este método permite estudiar comunidades microbianas y sus procesos metabólicos en ambientes naturales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto Estratégico de Subvenciones y descubrimiento de JDN de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC).

<ol><li>Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-specific+clades+of+active+marine+methylotrophs+associated+with+a+phytoplankton+bloom+in+a+temperate+coastal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).</li>
<li>Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+populations+active+in+metabolism+of+C1+compounds+in+the+sediment+of+Lake+Washington%2C+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).</li>
<li>Padmanabhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+of+13C-labelled+substrates+added+to+soil+in+the+field+and+subsequent+16S+rRNA+gene+analysis+of+13C-labelled+soil+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).</li>
<li>Bernard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+identification+of+soil+microbial+populations+actively+assimilating+carbon+from+13C-labelled+wheat+residue+as+estimated+by+DNA-+and+RNA-SIP+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques.</a> Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).</li>
<li>Haichar, elZ. ahar, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cellulolytic+bacteria+in+soil+by+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing.</a> Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).</li>
<li>Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing%3A+Technical+considerations+when+resolving+15N-labelled+RNA+in+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients.</a> J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).</li>
<li>Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+with+15N+achieved+by+disentangling+the+effects+of+genome+G+%2B+C+content+and+isotope+enrichment+on+DNA+density%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).</li>
<li>Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+growing+microorganisms+in+soil+by+stable+isotope+probing+with+H218O%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+the+use+of+stable+isotope+probing+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology.</a> Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).</li>
<li>Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+SYBR+safe+technique+for+the+sensitive+detection+of+DNA+in+cesium+chloride+density+gradients+for+stable+isotope+probing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.</a> J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).</li>
<li>Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+contamination+of+glycogen+used+in+nucleic+acid+precipitation+and+assessment+of+linear+polyacrylamide+as+an+alternative+co-precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant.</a> Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+uncultivated+majority%3A+combining+DNA+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomic+analyses+of+uncultivated+Methylocystis+in+acidic+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands.</a> Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).</li>
<li>Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+methylotrophs+revealed+by+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics.</a> Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).</li>
<li>Kalyuzhnaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metagenomics+targets+specific+functional+types+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2, 233-241 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+SJ+%22Microbiology+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).</li>
<li>Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+eats+what%2C+where+and+when%3F+Isotope-labelling+experiments+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age.</a> ISME J. 1, 103-110 (2007).</li>
<li>Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shortens+the+incubation+time+needed+to+detect+benzoate-utilizing+denitrifying+bacteria+by+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.</li>
</ol>

El diseño apropiado de isótopos estables experimentos de sondeo es de importancia crítica para la obtención de ADN marcado por encima de la comunidad de fondo sin etiquetar. Consideraciones relacionadas con la muestra de los tiempos de incubación, las concentraciones de sustrato, las condiciones de incubación (por ejemplo nutrientes, contenido de humedad del suelo), cruzar la alimentación y la replicación se han discutido en otros lugares 10,18 y se recomienda al lector consultar estas publicaciones en el dis...

<table><tbody><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cesio</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-500</td><td></td></tr><tr><td>Etil alcohol, grado reactivo</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>652261</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>351285212</td><td></td></tr><tr><td>Poliacrilamida lineal</td><td>Reactivo</td><td>Applichem</td><td>A6587</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 6000</td><td>Reactivo</td><td>VWR international</td><td>CAPX1286L-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42409-0010</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2711</td><td></td></tr><tr><td>Gránulos de hidróxido de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3181</td><td></td></tr><tr><td>Base de Tris</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Lector oscuro</td><td>Equipo</td><td>Clare Chemical</td><td>DR46B</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Equipo</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>361013650</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de infusión</td><td>Equipo</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>N/A</td><td>Número de modelo: BSP&lt;br/&gt;Consulte &lt;a href=&quot;http://www.braintreesci.com">www.braintreesci.com&lt;/a&gt; para detalles de pedido.</td></tr><tr><td>Sellador de tubos</td><td>Equipo</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Equipo</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga</td><td>Equipo</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362754</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz ultravioleta</td><td>Equipo</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0017-09</td><td>Cualquier fuente UV es adecuada</td></tr><tr><td>Protector facial para luz ultravioleta</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>114051C</td><td></td></tr><tr><td>Taponcillos de caucho butílico, grises</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27232</td><td></td></tr><tr><td>Tubos para centrífuga</td><td>Material</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342412</td><td></td></tr><tr><td>Aguja hipodérmica, calibre 23, longitud de 2&amp;#8221;</td><td>Material</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Tubos para microcentrífuga, 1,5 mL</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>AD151-N500</td><td></td></tr><tr><td>Sellos centrales abiertos, diámetro de 20 mm</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27230-U</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur, de vidrio</td><td>Material</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6C</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>BPS340-1000</td><td>El número de catálogo corresponde a puntas de 200 &amp;#x03BC;l. Pueden adquirirse puntas de 10 o 20 &amp;#x03BC;l del mismo proveedor</td></tr><tr><td>Tubo de bomba, diámetro interno de 1,5 mm x pared de 1,5 mm</td><td>Material</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos con tapón roscado, 15 mL</td><td>Material</td><td>DiaMed</td><td>AD15MLP-S</td><td></td></tr><tr><td>Viales de suero, volumen de 125 mL</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114014</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 60 mL</td><td>Material</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr></tbody></table>

adn de isótopos estables de palpado (adn-sip)

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

ADN de isótopos estables de sondeo (ADN-SIP) es una poderosa técnica para la identificación de microorganismos activos que asimilar ciertos sustratos de carbono y nutrientes en la biomasa celular. Como tal, esta técnica de cultivo-independiente ha sido una importante metodología para la asignación de la función metabólica de las diversas comunidades que habitan en una amplia gama de ambientes terrestres y acuáticos. Después de la incubación de una muestra ambiental con isótopos estables compuestos marcados, el ácido nucleico extraído se somete a ultracentrifugación en gradiente de densidad y el fraccionamiento del gradiente posteriores para separar los ácidos nucleicos de diferentes densidades. La purificación del ADN a partir de cloruro de cesio recupera no marcado y marcado de ADN para posterior caracterización molecular (por ejemplo, huellas dactilares, microarrays, bibliotecas clon, la metagenómica). Este protocolo de vídeo JoVe proporciona visuales paso a paso las explicaciones del protocolo de gradiente de densidad gradiente de fraccionamiento de ultracentrifugación, y la recuperación de ADN marcado. El protocolo también incluye la muestra de datos SIP y pone de relieve importantes consejos y precauciones que se deben considerar para asegurar el éxito de ADN-SIP análisis.

ADN de isótopos estables de sondeo es un método de cultivo independiente para identificar y caracterizar las comunidades activas de microorganismos que son capaces de utilizar sustratos específicos. Asimilación de sustrato enriquecido en los isótopos pesados ​​lleva a la incorporación de los átomos marcados en la biomasa microbiana. Ultracentrifugación en gradiente de densidad recupera la etiqueta de ADN para posterior análisis molecular.

ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)

El sondeo de isótopos estables del ADN (DNA-SIP) es una técnica potente para identificar microorganismos activos que asimilan sustratos de carbono particulares y...

El objetivo general de este procedimiento es recuperar ADN de microorganismos activos que han consumido un sustrato de crecimiento de interés, sin necesidad de cultivarlos en el laboratorio. Esto se logra primero incubando una muestra ambiental con un sustrato marcado con isótopos estables de interés, bajo condiciones similares a las presentes en el entorno natural. El segundo paso del procedimiento consiste en extraer el ADN total de esta muestra marcada con isótopos. El tercer paso del procedimiento consiste en someter este ADN a una ultracentrifugación en gradiente de densidad en cloruro de cesio. El paso final del procedimiento es fraccionar el gradiente de densidad para obtener ADN pesado y ligero destinado a la caracterización molecular posterior. En última instancia, se pueden obtener resultados que revelen la identidad de microorganismos activos pero no cultivados que participan en el metabolismo de un sustrato particular, mediante una variedad de técnicas moleculares posibles, incluyendo el perfilado, microarreglos, hibridación, análisis de bibliotecas de clones y metagenómica.Hola, soy Josh Neufeld del Departamento de Biología de la Universidad de Waterloo. Soy Eric Dunford, estudiante de posgrado en el Laboratorio Newfeld. Hoy les mostraremos un procedimiento para el marcado isotópico del ADN, o SIP de ADN, que se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada para vincular la identidad de microorganismos desconocidos y potencialmente no cultivados con su capacidad para utilizar un sustrato de crecimiento de interés.Utilizamos este procedimiento en el laboratorio Newfeld para estudiar el metabolismo de fuentes de carbono en una variedad de ambientes terrestres y acuáticos. Hoy les mostraremos la aplicación de un sustrato de carbono particular, glucosa 13 C, a una muestra de suelo. Sin embargo, reconocemos que desde que este método fue desarrollado inicialmente por el Grupo de Colin Merle en la Universidad de Warwick, los investigadores han diversificado el protocolo para aplicarlo a una variedad de ambientes diferentes y también utilizando una variedad de isótopos marcados distintos, como nitrógeno y oxígeno.Hoy nos centraremos en el carbono, pero el protocolo en sí puede aplicarse a diferentes diseños experimentales. Comencemos. Antes de iniciar este procedimiento, prepare todos los reactantes para el sondaje de isótopos estables de ADN o para el ADN CYP, tal como se describe en la parte escrita de este protocolo.DNAC comienza con la incubación de la muestra. Las condiciones de incubación varían ampliamente según una variedad de características de la muestra y del sustrato. Una vez que se han determinado empíricamente las condiciones adecuadas de incubación, agregue el enmienda de sustrato apropiado a la muestra ambiental.También puede optar por incluir nutrientes suplementarios para favorecer el crecimiento microbiano si estos son necesarios según las incubaciones de prueba. Una vez que se haya preparado la incubación de la muestra, tápela y séllela, luego incube las muestras ambientales que contienen el sustrato marcado. El ejemplo que se muestra implica la adición de una solución de glucosa marcada con carbono 13 a una muestra de suelo.A continuación, prepare un cultivo control para servir como comparación y confirmar la marcación aparente de ácidos nucleicos observada en los pasos posteriores. Prepare esta muestra en condiciones idénticas, excepto utilizando carbono no marcado como sustrato; tape, selle e incube la muestra ambiental con el sustrato no marcado en las mismas condiciones. Tras la incubación, extraiga el ADN de los microcosmos utilizando un protocolo de extracción adecuado para las aplicaciones posteriores deseadas. Luego, cuantifique el ADN extraído para los siguientes pasos de ultracentrifugación mediante electroforesis en gel y un espectrofotómetro.Utilice rotores verticales o casi verticales para la ultracentrifugación con el fin de garantizar la separación máxima posible del ADN ligero y pesado. El rotor Beckman Coulter VTI 65.2 tiene 16 pozos para alojar tubos poliméricos de sellado rápido de 5,1 mililitros para preparar muestras para ultracentrifugación. Primero, calcule el volumen de ADN extraído que se requiere para agregar de 0,5 a cinco microgramos de ADN a los tubos de ultracentrifugación.Utilizando las concentraciones de ADN determinadas previamente, determine luego la densidad exacta de la solución stock de cloruro de cesio mediante un refractómetro digital. Como se sugiere en el protocolo escrito, calcule el volumen de la solución de ADN en tampón de gradiente necesario para generar una proporción de mezcla adecuada.Utilizando estos cálculos, combine el ADN extraído con tampón de gradiente y 4,8 mililitros de cloruro de cesio en un tubo estéril desechable de 15 mililitros. El volumen resultante será mayor que la capacidad especificada de los tubos de centrífuga para llenar completamente los tubos. Finalmente, prepare la solución invirtiendo el tubo 10 veces en variaciones de este protocolo.Utilice una fuerza de gradiente, como bromuro de etidio, en la solución de gradiente para permitir la visualización del ADN dentro del tubo. Modificar la densidad del ADN al prepararlo con ADN de cultivo puro, incluyendo un gradiente de bromuro de AUM como se muestra aquí, es especialmente útil para obtener una confirmación visual inmediata de la formación del gradiente tras cada centrifugación. Los pasos a seguir al emplear este enfoque se describen en el protocolo escrito.Para preparar la ultracentrifugación, utilice una perilla y una pipeta para llenar cuidadosamente los tubos de ultracentrifugación con las soluciones de gradiente. Etiquete los tubos en el hombro del tubo con un marcador permanente de punta fina. Asegúrese de que los tubos se llenen exactamente hasta la base del cuello del tubo, ya que los tubos insuficientemente llenos tienden a reventar durante la ultracentrifugación.Una vez que todos los tubos requeridos estén llenos con las soluciones de muestra, registre la masa precisa de cada tubo, ordénelos en pares lo más parejos posible y agregue o retire pequeñas cantidades de solución hasta que estén equilibrados dentro de los 10 miligramos. Mantenga el nivel de la solución lo más cercano posible a la base del tapón del tubo. Luego, selle los tubos utilizando un tapón de tubo según las instrucciones del fabricante.Verifique que los tubos estén sellados correctamente invirtiéndolos y aplicando presión moderada. Pese nuevamente los tubos para comprobar que sigan equilibrados tras el sellado, antes de la ultracentrifugación. Inspeccione cuidadosamente cada cavidad del rotor para asegurarse de que estén limpias y libres de polvo y residuos que podrían perforar los tubos durante la ultracentrifugación.Introduzca los tubos en el rotor, colocando los pares equilibrados uno frente al otro. Registre la ubicación del rotor de cada muestra, ya que el proceso de ultracentrifugación puede hacer que las etiquetas de marcador sean ilegibles. Selle cuidadosamente los orificios del rotor según lo indicado por el fabricante.Una vez que se hayan sellado los pozos del rotor, coloque el rotor en el ultracentrífugo. Cierre la puerta del ultracentrífugo y aplique vacío para el rotor VTI 65.2. Establezca la velocidad de rotación en 44.100 RPM, la temperatura en 20 grados Celsius y el tiempo de ultracentrifugación entre 36 y 40 horas.Asegúrese de que el vacío esté activado, seleccione la aceleración máxima y desactive el freno para garantizar que el gradiente no se interrumpa por la desaceleración. Inmediatamente después de la ultracentrifugación, retire cuidadosamente el rotor. Tenga cuidado de no inclinar ni golpear el rotor para evitar alterar los gradientes dentro de los tubos.Finalmente, retire suavemente los tubos para la fraccionación del gradiente. El ADN se puede extraer de los tubos del ultracentrífugo utilizando la técnica de fraccionación. Para comenzar, llene una jeringa estéril de 60 mililitros con agua destilada y desionizada estéril que contenga suficiente colorante azul propofol.Para obtener un color azul oscuro, coloque la jeringa en el brazo de carga de la bomba de jeringa. A continuación, conecte el tubo de la bomba equipado con una aguja de una pulgada y calibre 23 y encienda la bomba hasta que salga algo de agua por el extremo de la aguja. Evite las burbujas de aire en el suministro de agua, ya que afectarán negativamente el proceso de fraccionamiento.Para cada muestra, prepare 12 tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 mililitros con etiquetas que indiquen el número de muestra y la fracción. A continuación, sujete uno de los tubos de ultracentrífuga a un soporte con pinza mediante un movimiento rápido y controlado. Perfore la parte inferior del tubo a lo largo de la costura del tubo utilizando una aguja nueva de 23 gauge y una pulgada de longitud, y gire la aguja para asegurarse de que se haya formado un orificio uniforme.Es posible que los guantes de látex ofrezcan un mejor agarre sobre el eje de la aguja que los guantes de nitrilo. Utilice la aguja conectada al tubo de la bomba para perforar la parte superior del tubo en el hombro superior del tubo, a lo largo de la costura, de manera rápida y controlada. Tenga en cuenta que también se puede perforar primero la parte superior del tubo y luego la parte inferior.Asimismo, tenga en cuenta que una pequeña cantidad de aceite mineral que recubra el hombro del tubo puede ayudar a prevenir fugas causadas por un sello inadecuado alrededor de la aguja superior cuando se utiliza una bomba con velocidad previamente calibrada. Introduzca el agua teñida en la parte superior del tubo para obtener 12 fracciones de 425 microlitros en 12 minutos. Utilice un temporizador para recoger la solución en gradiente en los tubos microcentrífugos etiquetados.Finalmente, verifique la densidad de todas las fracciones para al menos una muestra o gradiente control. Utilice un refractómetro digital. Espere valores en el rango de 1.690 a 1.760 gramos por mililitro, con una densidad media de aproximadamente 1.725 gramos por mililitro para precipitar el ADN de todas las fracciones.Primero, agregue 20 microgramos de poliacrilamida lineal como portador para la precipitación y mezcle por inversión. Luego, agregue dos volúmenes de solución de PEG y vuelva a mezclar por inversión. Deje los tubos a temperatura ambiente durante dos horas para permitir la precipitación del ADN tras la incubación.Coloque las muestras en una microcentrífuga con los tubos orientados en la misma dirección para garantizar una localización consistente del precipitado durante la centrifugación. Centrifugue los tubos a 13,000 G durante 30 minutos; tras la centrifugación, retire las muestras de la microcentrífuga y aspire con cuidado para desechar el sobrenadante. En esta etapa, el precipitado debe ser visible con la ayuda de una fuente de luz intensa.Lave el precipitado con 500 microlitros de etanol al 70 % después de lavar el precipitado en la centrífuga. Centrifugue las muestras a 13 000 ×g durante 10 minutos y, tras la centrifugación, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. El precipitado será ahora más visible, pero se disociará más fácilmente de la pared del tubo.Deje secar el pellet a temperatura ambiente durante 15 minutos. Una vez que los pellets hayan secado, suspenda cada pellet en 50 microlitros de tampón TE. Finalmente, corra cinco microlitros de cada fracción en un gel de agarosa para caracterizar las fracciones del gradiente utilizando los métodos descritos en el protocolo escrito.Los resultados típicos del SIP de ADN mostrarán una separación del ADN marcado y no marcado en forma de gradiente mediante ultracentrifugación. Idealmente, habrá una resolución completa del material genético de alto peso molecular, como el carbono 13 y el nitrógeno 15, respecto al material no marcado, en particular, huellas específicas basadas en PCR asociadas con las fracciones cuatro a ocho de muestras incubadas con isótopos estables, pero no con sustrato nativo. Los controles incubados proporcionan evidencia sólida que vincula organismos específicos con el metabolismo de un sustrato marcado determinado cuando se realizan con ADN de dos cultivos puros: la cepa de *Methyloccus capsulatus* marcada con carbono 13, cepa Bath, y *Sian medi* A TCC 10 21 no marcado; el ADN genómico marcado y no marcado se separa en fracciones de gradiente respectivas con densidades diferentes.En este ejemplo, se puede observar ADN marcado con isótopos pesados en las fracciones cuatro y cinco, mientras que el ADN no marcado se encuentra en altas concentraciones en las fracciones nueve y diez. El ADN amplificado por PCR a partir de las mismas fracciones se separó mediante electroforesis en gel desnaturalizante con gradiente, o DGGE, generando patrones de bandas discretos correspondientes a los dos organismos incluidos en el gradiente. La densidad de las fracciones varía aproximadamente entre 1,580 y 1,759 gramos por mililitro, y se muestran en orden de densidad decreciente de izquierda a derecha.Por el contrario, la separación de isótopos y las incubaciones de muestras ambientales pueden ser más difíciles de interpretar. Suelos de tundra de Resolute Bay, Canadá, se incubaron con glucosa marcada con carbono 12 o carbono 13 durante un período de 14 días a 15 grados Celsius. Los geles de agarosa del ADN fraccionado purificado revelaron una banda difusa de ADN genómico en las fracciones siete a diez, tanto en las incubaciones con carbono 12 como con carbono 13.Sin embargo, cuando se utilizó la electroforesis en gradiente desnaturalizante (DGGE) de genes de ARNr 16 s para determinar el enriquecimiento de carbono 13 en la biomasa de taxones microbianos particulares, la incubación del suelo con glucosa carbono 12 generó patrones similares en todas las fracciones del gradiente, mientras que la muestra incubada con glucosa carbono 13 produjo huellas DGGE únicamente asociadas con las fracciones cinco a ocho; las bandas conservadas indicadas por las flechas representaron un filotipo dominante consistente en todas las fracciones del gradiente. El filotipo se desplaza hacia fracciones más pesadas en el ADN obtenido del suelo incubado con glucosa carbono 13. La identidad de este gen particular de ARNr 16 s puede determinarse para orientar enfoques posteriores basados en metagenómica o en cultivo.Acabamos de mostrarle cómo realizar un experimento de sondaje con isótopos estables de ADN, desde la incubación de muestras hasta la obtención de ADN marcado para análisis molecular. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante considerar cuidadosamente el diseño experimental y tener cuidado de no agregar demasiado sustrato, con el fin de evitar sesgar el experimento hacia organismos de rápido crecimiento. También se debe evitar una incubación prolongada para que el sustrato no se diluya hacia otros miembros de la comunidad a través de una red trófica.Por lo tanto, desea utilizar solo la cantidad adecuada de sustrato y tiempos de incubación suficientes para permitirle detectar pequeñas cantidades de ADN marcado en fracciones pesadas mediante aplicaciones sensibles basadas en PCR. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un protocolo robusto y versátil para el análisis de la arquitectura nuclear por FISH 3D DNA usando sondas fluorescentes marcados directamente.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

La comunidad bacteriana activo asociado con el intestino de Spodoptera littoralis, se determinó por isótopos estables-palpador (SIP) acoplado a la pirosecuenciación. Utilizando esta metodología, se realizó la identificación de las especies de bacterias metabólicamente activas dentro de la comunidad con alta resolución y precisión.

La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Vía ADN isótopos estables Uso<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosa

Se desarrolló un método no etiquetados, radio-isotópico para la corrección de la polimerasa de la DNA y un ensayo de reparación del ADN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF alta resolución y una estrategia de extensión de un solo nucleótido. El ensayo demostró ser muy específico, simple, rápido y fácil de realizar para corregir y reparar los parches menor 9 nucleótidos.

Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

Este artículo presenta un protocolo detallado para ligadura de T4 y desnaturalización página purificación de moléculas pequeñas de ADN circular, recocido y del análisis de la página nativa de Tejas circular, montaje y proyección de imagen de AFM de nanoestructuras de ADN de 1D y 2D, así como de agarosa gel purificación de electroforesis y centrifugación de nanoestructuras de ADN finito.

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

Este documento describe un protocolo detallado para usar sondas de tensión basadas en ADN para obtener imágenes de las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunes. Este enfoque puede mapear las fuerzas del receptor &gt;4.7pN en tiempo real y puede integrar fuerzas a lo largo del tiempo.

Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

El protocolo proporciona instrucciones para modificar el ARN con sulfato de dimetilo para experimentos de perfiles mutacionales. Incluye sondeo in vitro e in vivo con dos métodos alternativos de preparación de bibliotecas.

Sondeo de la estructura del ARN con perfil mutacional de sulfato de dimetilo con secuenciación in vitro y en células

El enriquecimiento y secuenciación del ADN naciente asociado a proteínas (eSPAN) se desarrolló para detectar la abundancia relativa de una proteína asociada a la cromatina en dos cadenas de ADN replicantes, revelando así una visión molecular sobre la replicación de la cromatina y sus procesos acoplados. Este protocolo describe los procedimientos eSPAN en células madre embrionarias (ES) de levaduras y ratones.

Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas

Este protocolo describe un ensayo de replicación de ADN de una sola molécula basado en microscopía de fluorescencia, que permite la visualización en tiempo real de las interacciones entre las ADN polimerasas y obstáculos como las estructuras G-cuádruples.

Visualización de fluorescencia de una sola molécula de la dinámica de la ADN polimerasa en G-Quadruplex

En este video, te mostramos cómo los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de las células madre embrionarias humanas pueden ser analizadas utilizando en ensayos de actividad gel.

Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

Aprende a identificar microorganismos activos mediante sondeo de isótopos estables en ADN sin necesidad de cultivo. Este método permite estudiar comunidades microbianas y sus procesos metabólicos en ambientes naturales.

ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)

Explorar más videos