ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)

El objetivo general de este procedimiento es recuperar ADN de microorganismos activos que han consumido un sustrato de crecimiento de interés sin el requisito previo de cultivo en laboratorio. Esto se logra incubando primero una muestra ambiental con un sustrato de interés marcado con isótopos estables en condiciones similares a las que se encuentran en el entorno nativo. El segundo paso del procedimiento es extraer el ADN total de esta muestra marcada con isótopos.

El tercer paso del procedimiento es someter este ADN a ultracentrifugación en gradiente de densidad en cloruro de cesio. El paso final del procedimiento es fraccionar el gradiente de densidad para obtener ADN pesado y ligero para su posterior caracterización molecular. En última instancia, se pueden obtener resultados que revelen la identidad de microorganismos activos aún no cultivados involucrados en el metabolismo de un sustrato en particular a través de una variedad de técnicas moleculares posibles, que incluyen huellas dactilares, microarrays, hibridación, clonación, análisis de bibliotecas y metagenómica.

Hola, soy Josh Neufeld del Departamento de Biología de la Universidad de Waterloo. Soy Eric Dunford, estudiante de posgrado en el Newfeld Lab. Hoy vamos a mostrar un procedimiento para el sondeo de isótopos de ADN, o DNA sip, que se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada para vincular la identidad de microorganismos desconocidos y potencialmente no cultivados con su capacidad para utilizar un sustrato de crecimiento de interés.

Utilizamos este procedimiento en el laboratorio de Newfeld para estudiar el metabolismo de las fuentes de carbono en una variedad de entornos terrestres y acuáticos. Hoy te mostraremos la aplicación de un sustrato de carbono en particular, glucosa 13 C, a una muestra de suelo. Pero reconocemos que desde que este método fue desarrollado por primera vez por el grupo de Colin Merle en la Universidad de Warwick, los investigadores han diversificado el protocolo para aplicarlo a una variedad de entornos diferentes y también utilizando una variedad de isótopos marcados diferentes como el nitrógeno y el oxígeno.

Hoy nos centraremos en el carbono, pero el protocolo en sí se puede aplicar a diferentes diseños experimentales. Así que comencemos. Antes del inicio de este procedimiento, prepare todos los reactivos de sondeo de isótopos estables de ADN o CYP de ADN como se describe en la parte escrita de este protocolo.

El DNAC comienza con la incubación de la muestra. Las condiciones de incubación varían ampliamente dependiendo de una variedad de características de la muestra y el sustrato. Una vez que se hayan determinado empíricamente las condiciones de incubación apropiadas, agregue la enmienda de sustrato apropiada a la muestra ambiental.

También puede optar por incluir nutrientes suplementarios para permitir el crecimiento microbiano si es necesario en función de las incubaciones de prueba. Una vez que se haya configurado la incubación de la muestra, tape y selle la muestra, luego incube las muestras ambientales que contengan sustrato marcado. El ejemplo que se muestra implica la adición de una solución de glucosa marcada con carbono 13 a una muestra de suelo.

A continuación, configure una incubación de control que sirva de comparación para confirmar el marcaje aparente del ácido nucleico observado en los pasos posteriores. Prepare esta muestra en condiciones idénticas, excepto usando carbono no marcado como tapa de sustrato, selle e incube la muestra ambiental con sustrato no marcado en las mismas condiciones después del extracto de incubación, el ADN del microcosmos utilizando un protocolo de extracción que sea adecuado para las aplicaciones posteriores deseadas. A continuación, cuantifique el ADN extraído para los siguientes pasos de ultracentrifugación utilizando gel aous y un espectrofotómetro.

Utilice rotores verticales o casi verticales para la ultracentrifugación para garantizar la máxima separación posible de ADN ligero y pesado. El rotor VTI 65.2 de Beckman Coulter tiene 16 pocillos para contener tubos de polímero de sellado rápido de 5,1 mililitros para preparar muestras para la ultracentrifugación. En primer lugar, calcule el volumen de ADN extraído que se requiere para añadir de 0,5 a cinco microgramos de ADN a los tubos de ultracentrífuga.

Utilizando las concentraciones de ADN previamente determinadas. A continuación, determine la densidad exacta de la solución madre de cloruro de cesio utilizando un refractómetro digital. Como se sugiere en el protocolo escrito, calcule el volumen de solución de ADN tampón de gradiente necesario para generar una proporción de mezcla adecuada.

Usando estos cálculos, combine el ADN extraído con tampón de gradiente y 4,8 mililitros de cloruro de cesio en un tubo estéril desechable de 15 mililitros. El volumen resultante será mayor que la capacidad especificada de los tubos de centrífuga para llenar completamente los tubos. Finalmente se realiza la solución invirtiendo el tubo 10 veces variaciones de este protocolo.

Utilice una fuerza de flora como ahy y bromuro dentro de la solución de gradiente para permitir que el ADN se visualice dentro del tubo. La alteración de la densidad del ADN cuando se prepara con ADN de cultivo puro, incluido un gradiente de bromuro AUM como se muestra aquí, es particularmente útil para proporcionar una confirmación visual inmediata de la formación de gradiente después de cada centrífuga. Los pasos de ejecución para utilizar este enfoque se describen en el protocolo escrito.

Para configurar primero la ultracentrifugación, use una bombilla y pase una pipeta para llenar cuidadosamente los tubos de ultracentrífuga con las soluciones de gradiente. Etiquete los tubos en el hombro del tubo con un marcador permanente fino. Asegúrese de que los tubos se llenen exactamente hasta la base del cuello del tubo, ya que los tubos insuficientemente llenos tienden a reventar durante la ultracentrifugación.

Una vez que todos los tubos requeridos estén llenos con las soluciones de muestra, registre la masa precisa de cada tubo, clasifique los tubos como pares muy coincidentes y agregue o elimine mis nuevas cantidades de solución hasta que estén equilibradas dentro de los 10 miligramos. Mantenga el nivel de la solución lo más cerca posible de la base del tubo. A continuación, selle los tubos con un adorno para tubos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Compruebe que los tubos estén correctamente sellados invirtiéndolos y aplicando una presión moderada. Vuelva a pesar los tubos para comprobar que siguen equilibrados después del sellado antes de la ultracentrifugación. Inspeccione cuidadosamente cada pozo del rotor para asegurarse de que estén limpios y libres de polvo y residuos que puedan perforar los tubos durante la ultracentrifugación.

Inserte los tubos en el rotor, colocando los pares equilibrados uno frente al otro. Registre la ubicación del rotor de cada muestra, ya que el proceso de ultracentrifugación puede hacer que las etiquetas de los marcadores sean legibles. Selle cuidadosamente los pozos del rotor según lo indicado por el fabricante.

Una vez que se hayan sellado los pozos del rotor, cargue el rotor en la ultracentrífuga. Cierre la puerta de la ultracentrífuga y aplique un vacío para el rotor VTI 65.2. Ajuste la velocidad de rotación a 44, 100 RPM, la temperatura a 20 grados centígrados y el tiempo de ultracentrifugación a 36 a 40 horas.

Asegúrese de que el vacío esté encendido, seleccione la aceleración máxima y apague el freno para asegurarse de que la pendiente no se vea interrumpida por la desaceleración. Inmediatamente después de la ultracentrifugación, retire el rotor con cuidado. Tenga cuidado de no inclinar o golpear el rotor para evitar perturbar las pendientes dentro de los tubos.

Finalmente, retire suavemente los tubos para el fraccionamiento en gradiente. El ADN se puede extraer de los tubos de ultracentrífuga mediante la técnica de fraccionamiento. Para comenzar, llene una jeringa estéril de 60 mililitros con agua estéril destilada y desionizada que contenga suficiente tinte azul de propofol.

Para proporcionar un color azul oscuro, coloque la jeringa en el brazo de carga de la bomba de jeringa. A continuación, conecte el tubo de la bomba equipado con una aguja de una pulgada de calibre 23 y encienda la bomba hasta que salga algo de agua por el extremo de la aguja. Evite las burbujas de aire en el suministro de agua, ya que afectarán negativamente el proceso de fraccionamiento.

Para cada muestra, prepare 12 tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros con etiquetas que indiquen el número y la fracción de la muestra. A continuación, fije uno de los tubos de ultracentrifugación a un soporte de abrazadera con un movimiento rápido y controlado. Perfore la parte inferior del tubo a lo largo de la costura del tubo con una aguja nueva de una pulgada de calibre 23 y gire la aguja para asegurarse de que se haya formado un orificio uniforme.

Es posible que descubra que los guantes de látex proporcionan un mejor agarre en el eje de la aguja que los guantes de nitrilo. Con la aguja que está unida al tubo de la bomba, perfore la parte superior del tubo en el hombro del tubo superior a lo largo de la costura de manera rápida y controlada. Tenga en cuenta que también se puede perforar la parte superior del tubo seguido de la parte inferior del tubo.

Además, tenga en cuenta que una pequeña cantidad de aceite mineral que recubre el hombro del tubo puede ayudar a prevenir fugas de un sello incorrecto alrededor de la aguja superior con una velocidad de bombeo previamente calibrada. Bombee el agua teñida en la parte superior del tubo para producir 12 425 fracciones de microlitros en 12 minutos. Utilice un temporizador para recoger la solución de gradiente en los tubos de microcentrífuga etiquetados.

Por último, compruebe la densidad de todas las fracciones para al menos una muestra o gradiente de control. Usando un refractómetro digital. Se esperan valores en el rango de 1,690 a 1,760 gramos por mililitro con una densidad media de aproximadamente 1,725 gramos por mililitro para precipitar el ADN de todas las fracciones.

En primer lugar, añadir 20 microgramos de poliacrilamida lineal como portador de precipitación y mezclar por inversión. A continuación, añada dos volúmenes de solución de PEG y, de nuevo, mezcle por inversión. Deje los tubos a temperatura ambiente durante dos horas para permitir que el ADN se precipite después de la incubación.

Colocó las muestras en una microcentrífuga con los tubos orientados en la misma dirección para garantizar una localización consistente de la centrífuga de pellets. Los tubos a 13.000 g durante 30 minutos después de la centrifugación recuperaron las muestras de la microcentrífuga, luego aspiraron cuidadosamente y desecharon la aplicación supernat. El pellet debe ser visible en esta etapa con la ayuda de una fuente de luz brillante.

Lave el pellet con 500 microlitros de etanol al 70% después de lavar la centrífuga de pellets. Las muestras a 13.000 g durante 10 minutos después de la centrifugación aspiran cuidadosamente y desechan el supernat. El pellet será más visible ahora, pero se disociará de la pared del tubo más fácilmente.

Deje que el pellet se seque a temperatura ambiente durante 15 minutos. Una vez que los pellets se hayan secado, suspenda cada pellet en 50 microlitros de tampón TE. Finalmente, ejecute cinco microlitros de cada fracción en un gel aeros para caracterizar las fracciones de gradiente utilizando los métodos discutidos en el protocolo escrito.

Los resultados típicos de ADN SIP demostrarán una separación de ADN marcado y no marcado en forma de gradiente por ultracentrifugación. Idealmente, habrá una resolución completa de material genético de alto peso molecular, como el carbono 13 y el nitrógeno 15, a partir de material no etiquetado en particular, huellas dactilares únicas basadas en PCR asociadas con las fracciones cuatro a ocho de muestras incubadas con isótopos estables, pero no con sustrato nativo. Los controles incubados proporcionan pruebas sólidas que vinculan organismos específicos con el metabolismo de un sustrato marcado particular cuando se realizan en ADN de dos cultivos puros, un baño de cepa de metil occus capsulitis marcado con carbono 13 y un Sian medi A TCC 10 21 sin marcar, marcado con un ADN genómico no marcado, separado en fracciones de gradiente respetadas con diferentes densidades.

En este ejemplo, el ADN marcado con isótopos pesados se puede observar en las fracciones cuatro a cinco, mientras que el ADN no marcado se encuentra en altas concentraciones en las fracciones nueve a 10. El ADN amplificado por PCR de las mismas fracciones se ejecutó mediante electroforesis en gel de desnaturalización y gradiente o DGGE y generó patrones de bandas discretos correspondientes a los dos organismos incluidos en el gradiente. La densidad de las fracciones oscila entre aproximadamente 1,580 y 1,759 gramos por mililitro, y se muestran en orden decreciente de densidad de izquierda a derecha.

Por el contrario, la separación de isótopos y las incubaciones de muestras ambientales pueden ser más difíciles de interpretar. Los suelos de tundra de Resolute Bay, Canadá, se incubaron con glucosa marcada con carbono 12 o carbono 13 durante un período de 14 días a 15 grados centígrados. Los geles aeros de la fracción de gradiente purificada de ADN revelaron un frotis de ADN genómico en las fracciones siete a 10 para las incubaciones de carbono 12 y carbono 13.

Sin embargo, cuando se utilizó DGGE de genes de ARN ribosómico 16 s para determinar el enriquecimiento de carbono 13 de la biomasa de taxones microbianos particulares, el suelo incubado con glucosa 12 carbono, el ADN generó patrones similares en todas las fracciones de gradiente, mientras que la muestra incubada con glucosa 13 generó huellas dactilares DGG que se asocian de manera única con las fracciones cinco a ocho. Las bandas conservadas indicadas por las flechas representan el tipo de filo dominante, consistente en todas las fracciones de gradiente. El tipo de filo cambia a fracciones más pesadas para el ADN obtenido del suelo incubado con glucosa de carbono 13. La identidad de este gen particular de ARN ribosómico 16 s se puede determinar para guiar los enfoques metagenómicos o basados en el cultivo posteriores.

Acabamos de mostrarle cómo realizar un experimento de sondeo de isótopos estables de ADN, desde la incubación de muestras hasta la obtención de ADN marcado para análisis molecular. Al realizar este procedimiento, es importante considerar cuidadosamente el diseño experimental, tener cuidado de evitar agregar demasiado sustrato para evitar sesgar el experimento hacia organismos de rápido crecimiento. También debes evitar la incubación prolongada para que el sustrato no se diluya a otros miembros de una comunidad a través de una red alimentaria.

Por lo tanto, debe utilizar la cantidad justa de sustrato y los tiempos de incubación suficientes para permitir detectar una pequeña cantidad de ADN marcado en fracciones pesadas con aplicaciones sensibles basadas en PCR. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.