ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)

El objetivo general de este procedimiento es recuperar ADN de microorganismos activos que han consumido un sustrato de crecimiento de interés, sin necesidad de cultivarlos en el laboratorio. Esto se logra primero incubando una muestra ambiental con un sustrato marcado con isótopos estables de interés, bajo condiciones similares a las presentes en el entorno natural. El segundo paso del procedimiento consiste en extraer el ADN total de esta muestra marcada con isótopos.

El tercer paso del procedimiento consiste en someter este ADN a una ultracentrifugación en gradiente de densidad en cloruro de cesio. El paso final del procedimiento es fraccionar el gradiente de densidad para obtener ADN pesado y ligero destinado a la caracterización molecular posterior. En última instancia, se pueden obtener resultados que revelen la identidad de microorganismos activos pero no cultivados que participan en el metabolismo de un sustrato particular, mediante una variedad de técnicas moleculares posibles, incluyendo el perfilado, microarreglos, hibridación, análisis de bibliotecas de clones y metagenómica.

Hola, soy Josh Neufeld del Departamento de Biología de la Universidad de Waterloo. Soy Eric Dunford, estudiante de posgrado en el Laboratorio Newfeld. Hoy les mostraremos un procedimiento para el marcado isotópico del ADN, o SIP de ADN, que se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada para vincular la identidad de microorganismos desconocidos y potencialmente no cultivados con su capacidad para utilizar un sustrato de crecimiento de interés.

Utilizamos este procedimiento en el laboratorio Newfeld para estudiar el metabolismo de fuentes de carbono en una variedad de ambientes terrestres y acuáticos. Hoy les mostraremos la aplicación de un sustrato de carbono particular, glucosa 13 C, a una muestra de suelo. Sin embargo, reconocemos que desde que este método fue desarrollado inicialmente por el Grupo de Colin Merle en la Universidad de Warwick, los investigadores han diversificado el protocolo para aplicarlo a una variedad de ambientes diferentes y también utilizando una variedad de isótopos marcados distintos, como nitrógeno y oxígeno.

Hoy nos centraremos en el carbono, pero el protocolo en sí puede aplicarse a diferentes diseños experimentales. Comencemos. Antes de iniciar este procedimiento, prepare todos los reactantes para el sondaje de isótopos estables de ADN o para el ADN CYP, tal como se describe en la parte escrita de este protocolo.

DNAC comienza con la incubación de la muestra. Las condiciones de incubación varían ampliamente según una variedad de características de la muestra y del sustrato. Una vez que se han determinado empíricamente las condiciones adecuadas de incubación, agregue el enmienda de sustrato apropiado a la muestra ambiental.

También puede optar por incluir nutrientes suplementarios para favorecer el crecimiento microbiano si estos son necesarios según las incubaciones de prueba. Una vez que se haya preparado la incubación de la muestra, tápela y séllela, luego incube las muestras ambientales que contienen el sustrato marcado. El ejemplo que se muestra implica la adición de una solución de glucosa marcada con carbono 13 a una muestra de suelo.

A continuación, prepare un cultivo control para servir como comparación y confirmar la marcación aparente de ácidos nucleicos observada en los pasos posteriores. Prepare esta muestra en condiciones idénticas, excepto utilizando carbono no marcado como sustrato; tape, selle e incube la muestra ambiental con el sustrato no marcado en las mismas condiciones. Tras la incubación, extraiga el ADN de los microcosmos utilizando un protocolo de extracción adecuado para las aplicaciones posteriores deseadas. Luego, cuantifique el ADN extraído para los siguientes pasos de ultracentrifugación mediante electroforesis en gel y un espectrofotómetro.

Utilice rotores verticales o casi verticales para la ultracentrifugación con el fin de garantizar la separación máxima posible del ADN ligero y pesado. El rotor Beckman Coulter VTI 65.2 tiene 16 pozos para alojar tubos poliméricos de sellado rápido de 5,1 mililitros para preparar muestras para ultracentrifugación. Primero, calcule el volumen de ADN extraído que se requiere para agregar de 0,5 a cinco microgramos de ADN a los tubos de ultracentrifugación.

Utilizando las concentraciones de ADN determinadas previamente, determine luego la densidad exacta de la solución stock de cloruro de cesio mediante un refractómetro digital. Como se sugiere en el protocolo escrito, calcule el volumen de la solución de ADN en tampón de gradiente necesario para generar una proporción de mezcla adecuada.

Utilizando estos cálculos, combine el ADN extraído con tampón de gradiente y 4,8 mililitros de cloruro de cesio en un tubo estéril desechable de 15 mililitros. El volumen resultante será mayor que la capacidad especificada de los tubos de centrífuga para llenar completamente los tubos. Finalmente, prepare la solución invirtiendo el tubo 10 veces en variaciones de este protocolo.

Utilice una fuerza de gradiente, como bromuro de etidio, en la solución de gradiente para permitir la visualización del ADN dentro del tubo. Modificar la densidad del ADN al prepararlo con ADN de cultivo puro, incluyendo un gradiente de bromuro de AUM como se muestra aquí, es especialmente útil para obtener una confirmación visual inmediata de la formación del gradiente tras cada centrifugación. Los pasos a seguir al emplear este enfoque se describen en el protocolo escrito.

Para preparar la ultracentrifugación, utilice una perilla y una pipeta para llenar cuidadosamente los tubos de ultracentrifugación con las soluciones de gradiente. Etiquete los tubos en el hombro del tubo con un marcador permanente de punta fina. Asegúrese de que los tubos se llenen exactamente hasta la base del cuello del tubo, ya que los tubos insuficientemente llenos tienden a reventar durante la ultracentrifugación.

Una vez que todos los tubos requeridos estén llenos con las soluciones de muestra, registre la masa precisa de cada tubo, ordénelos en pares lo más parejos posible y agregue o retire pequeñas cantidades de solución hasta que estén equilibrados dentro de los 10 miligramos. Mantenga el nivel de la solución lo más cercano posible a la base del tapón del tubo. Luego, selle los tubos utilizando un tapón de tubo según las instrucciones del fabricante.

Verifique que los tubos estén sellados correctamente invirtiéndolos y aplicando presión moderada. Pese nuevamente los tubos para comprobar que sigan equilibrados tras el sellado, antes de la ultracentrifugación. Inspeccione cuidadosamente cada cavidad del rotor para asegurarse de que estén limpias y libres de polvo y residuos que podrían perforar los tubos durante la ultracentrifugación.

Introduzca los tubos en el rotor, colocando los pares equilibrados uno frente al otro. Registre la ubicación del rotor de cada muestra, ya que el proceso de ultracentrifugación puede hacer que las etiquetas de marcador sean ilegibles. Selle cuidadosamente los orificios del rotor según lo indicado por el fabricante.

Una vez que se hayan sellado los pozos del rotor, coloque el rotor en el ultracentrífugo. Cierre la puerta del ultracentrífugo y aplique vacío para el rotor VTI 65.2. Establezca la velocidad de rotación en 44.100 RPM, la temperatura en 20 grados Celsius y el tiempo de ultracentrifugación entre 36 y 40 horas.

Asegúrese de que el vacío esté activado, seleccione la aceleración máxima y desactive el freno para garantizar que el gradiente no se interrumpa por la desaceleración. Inmediatamente después de la ultracentrifugación, retire cuidadosamente el rotor. Tenga cuidado de no inclinar ni golpear el rotor para evitar alterar los gradientes dentro de los tubos.

Finalmente, retire suavemente los tubos para la fraccionación del gradiente. El ADN se puede extraer de los tubos del ultracentrífugo utilizando la técnica de fraccionación. Para comenzar, llene una jeringa estéril de 60 mililitros con agua destilada y desionizada estéril que contenga suficiente colorante azul propofol.

Para obtener un color azul oscuro, coloque la jeringa en el brazo de carga de la bomba de jeringa. A continuación, conecte el tubo de la bomba equipado con una aguja de una pulgada y calibre 23 y encienda la bomba hasta que salga algo de agua por el extremo de la aguja. Evite las burbujas de aire en el suministro de agua, ya que afectarán negativamente el proceso de fraccionamiento.

Para cada muestra, prepare 12 tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 mililitros con etiquetas que indiquen el número de muestra y la fracción. A continuación, sujete uno de los tubos de ultracentrífuga a un soporte con pinza mediante un movimiento rápido y controlado. Perfore la parte inferior del tubo a lo largo de la costura del tubo utilizando una aguja nueva de 23 gauge y una pulgada de longitud, y gire la aguja para asegurarse de que se haya formado un orificio uniforme.

Es posible que los guantes de látex ofrezcan un mejor agarre sobre el eje de la aguja que los guantes de nitrilo. Utilice la aguja conectada al tubo de la bomba para perforar la parte superior del tubo en el hombro superior del tubo, a lo largo de la costura, de manera rápida y controlada. Tenga en cuenta que también se puede perforar primero la parte superior del tubo y luego la parte inferior.

Asimismo, tenga en cuenta que una pequeña cantidad de aceite mineral que recubra el hombro del tubo puede ayudar a prevenir fugas causadas por un sello inadecuado alrededor de la aguja superior cuando se utiliza una bomba con velocidad previamente calibrada. Introduzca el agua teñida en la parte superior del tubo para obtener 12 fracciones de 425 microlitros en 12 minutos. Utilice un temporizador para recoger la solución en gradiente en los tubos microcentrífugos etiquetados.

Finalmente, verifique la densidad de todas las fracciones para al menos una muestra o gradiente control. Utilice un refractómetro digital. Espere valores en el rango de 1.690 a 1.760 gramos por mililitro, con una densidad media de aproximadamente 1.725 gramos por mililitro para precipitar el ADN de todas las fracciones.

Primero, agregue 20 microgramos de poliacrilamida lineal como portador para la precipitación y mezcle por inversión. Luego, agregue dos volúmenes de solución de PEG y vuelva a mezclar por inversión. Deje los tubos a temperatura ambiente durante dos horas para permitir la precipitación del ADN tras la incubación.

Coloque las muestras en una microcentrífuga con los tubos orientados en la misma dirección para garantizar una localización consistente del precipitado durante la centrifugación. Centrifugue los tubos a 13,000 G durante 30 minutos; tras la centrifugación, retire las muestras de la microcentrífuga y aspire con cuidado para desechar el sobrenadante. En esta etapa, el precipitado debe ser visible con la ayuda de una fuente de luz intensa.

Lave el precipitado con 500 microlitros de etanol al 70 % después de lavar el precipitado en la centrífuga. Centrifugue las muestras a 13 000 ×g durante 10 minutos y, tras la centrifugación, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. El precipitado será ahora más visible, pero se disociará más fácilmente de la pared del tubo.

Deje secar el pellet a temperatura ambiente durante 15 minutos. Una vez que los pellets hayan secado, suspenda cada pellet en 50 microlitros de tampón TE. Finalmente, corra cinco microlitros de cada fracción en un gel de agarosa para caracterizar las fracciones del gradiente utilizando los métodos descritos en el protocolo escrito.

Los resultados típicos del SIP de ADN mostrarán una separación del ADN marcado y no marcado en forma de gradiente mediante ultracentrifugación. Idealmente, habrá una resolución completa del material genético de alto peso molecular, como el carbono 13 y el nitrógeno 15, respecto al material no marcado, en particular, huellas específicas basadas en PCR asociadas con las fracciones cuatro a ocho de muestras incubadas con isótopos estables, pero no con sustrato nativo. Los controles incubados proporcionan evidencia sólida que vincula organismos específicos con el metabolismo de un sustrato marcado determinado cuando se realizan con ADN de dos cultivos puros: la cepa de *Methyloccus capsulatus* marcada con carbono 13, cepa Bath, y *Sian medi* A TCC 10 21 no marcado; el ADN genómico marcado y no marcado se separa en fracciones de gradiente respectivas con densidades diferentes.

En este ejemplo, se puede observar ADN marcado con isótopos pesados en las fracciones cuatro y cinco, mientras que el ADN no marcado se encuentra en altas concentraciones en las fracciones nueve y diez. El ADN amplificado por PCR a partir de las mismas fracciones se separó mediante electroforesis en gel desnaturalizante con gradiente, o DGGE, generando patrones de bandas discretos correspondientes a los dos organismos incluidos en el gradiente. La densidad de las fracciones varía aproximadamente entre 1,580 y 1,759 gramos por mililitro, y se muestran en orden de densidad decreciente de izquierda a derecha.

Por el contrario, la separación de isótopos y las incubaciones de muestras ambientales pueden ser más difíciles de interpretar. Suelos de tundra de Resolute Bay, Canadá, se incubaron con glucosa marcada con carbono 12 o carbono 13 durante un período de 14 días a 15 grados Celsius. Los geles de agarosa del ADN fraccionado purificado revelaron una banda difusa de ADN genómico en las fracciones siete a diez, tanto en las incubaciones con carbono 12 como con carbono 13.

Sin embargo, cuando se utilizó la electroforesis en gradiente desnaturalizante (DGGE) de genes de ARNr 16 s para determinar el enriquecimiento de carbono 13 en la biomasa de taxones microbianos particulares, la incubación del suelo con glucosa carbono 12 generó patrones similares en todas las fracciones del gradiente, mientras que la muestra incubada con glucosa carbono 13 produjo huellas DGGE únicamente asociadas con las fracciones cinco a ocho; las bandas conservadas indicadas por las flechas representaron un filotipo dominante consistente en todas las fracciones del gradiente. El filotipo se desplaza hacia fracciones más pesadas en el ADN obtenido del suelo incubado con glucosa carbono 13. La identidad de este gen particular de ARNr 16 s puede determinarse para orientar enfoques posteriores basados en metagenómica o en cultivo.

Acabamos de mostrarle cómo realizar un experimento de sondaje con isótopos estables de ADN, desde la incubación de muestras hasta la obtención de ADN marcado para análisis molecular. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante considerar cuidadosamente el diseño experimental y tener cuidado de no agregar demasiado sustrato, con el fin de evitar sesgar el experimento hacia organismos de rápido crecimiento. También se debe evitar una incubación prolongada para que el sustrato no se diluya hacia otros miembros de la comunidad a través de una red trófica.

Por lo tanto, desea utilizar solo la cantidad adecuada de sustrato y tiempos de incubación suficientes para permitirle detectar pequeñas cantidades de ADN marcado en fracciones pesadas mediante aplicaciones sensibles basadas en PCR. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.