Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Este video muestra la microdisección de la retina y de la retina con pigmento retinal, epitelio, o EPR, adherido a embriones de pez cebra entre uno y tres días después de la fertilización. Todos los procedimientos pueden realizarse con pinzas finas y materiales de laboratorio comunes. Bajo microscopios estereoscópicos estándar para la disección retinal, la capa simple de EPR se elimina y desprende mediante una acción de cepillado y la adherencia del EPR a la superficie de la placa de cultivo.

Para la disección de retina con epitelio pigmentario retiniano (RPE) adherido, las propiedades adhesivas de la placa de cultivo se eliminan mediante trituración embrionaria y lavado previo a la disección. Para preservar intacto el RPE, un levantamiento cuidadoso de este tejido separa eficientemente la coroides y la esclerótica del retina con RPE adherido, seguido de la eliminación del cristalino utilizando una aguja de tungsteno grabada químicamente. Este método de disección permite obtener tejidos de retina intactos y ha sido utilizado con éxito para estudiar la expresión específica de ARN y los perfiles del retina y del epitelio pigmentario retiniano de pez cebra.

Hola, soy Li Jang del laboratorio del profesor UFE Leon en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Purdue. Hoy les mostraré cómo diseccionar tejidos oculares embrionarios de pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la red génica que regula el desarrollo del ojo.

Así que comencemos. Ocho. Antes de la microdisección, prepare las siguientes soluciones: solución de Ringer E3, medio filtrado y esterilizado, y hidróxido de sodio al cinco por ciento.

A continuación, ataque químicamente las agujas de tungsteno. Coloque un vaso de precipitados pequeño en una placa de Petri utilizando arcilla para facilitar el manejo del vaso y prevenir derrames de hidróxido de sodio. Sujete un clip metálico estándar al costado del vaso de precipitados.

Vierta cinco hidróxido de sodio normales en el vaso de precipitados hasta que el clip entre en contacto con el hidróxido de sodio. Conecte el electrodo negativo de una fuente de alimentación de corriente continua al clip y el electrodo positivo a un extremo de un pequeño trozo de alambre de tungsteno. Envuelva el otro extremo del alambre de tungsteno con una bola de arcilla de cuatro milímetros de diámetro y sumerja este extremo en la solución de hidróxido de sodio.

Aumente el voltaje a aproximadamente tres voltios y sumerja el alambre hacia arriba y hacia abajo en intervalos de un segundo en la solución de hidróxido de sodio durante unos 10 minutos. El alambre de tungsteno expuesto al hidróxido de sodio se volverá gradualmente más delgado, y cuando la bola de arcilla se desprenda, el extremo del alambre conectado al electrodo positivo tendrá una forma de aguja afilada. Enjuague la aguja afilada con solución de Ringer o E tres para eliminar los depósitos de sal y sujete la aguja a un aplicador de madera con cinta adhesiva o un portaagujas para facilitar su manipulación. Para preparar embriones para la disección.

Mantenga los peces adultos super según los protocolos estándar la noche anterior al apareamiento. Separe los peces parentales en tanques de apareamiento estáticos por pares utilizando un divisor. Retire el divisor después de encender la luz de la habitación a la mañana siguiente y permita que los padres se crucen a intervalos de 10 minutos cada media hora, separando los peces tras cada cruce.

Mantenga los embriones recolectados de cada cruce en medio E3 por separado a 28 grados Celsius. Determine la etapa de los embriones a las 10-12 horas posteriores a la fertilización y vuelva a determinarla inmediatamente antes de la disección en los puntos de tiempo específicos. Utilice placas de cultivo de poliestireno Falcon de 60 por 15 milímetros para la disección.

Una placa nueva y sin usar tiene una propiedad adhesiva intrínseca para el tejido de epitelio pigmentario de la retina (RPE) de hasta aproximadamente 20 minutos, y puede facilitar la eliminación del RPE en disecciones retinianas. Si se desea una retina con RPE adherido, esta propiedad adhesiva puede superarse triturando completamente dos embriones en una placa de cultivo que contenga solución de Ringer, dejándolos durante 30 minutos antes de la disección, seguido de lavados extensos con solución de Ringer fresca antes de la disección. Todas las disecciones finas se realizan con un aumento de aproximadamente cinco a ocho veces en un microscopio Olympus SC X 16 con un objetivo de una vez.

Utilizando fórceps Dumont o una aguja de tungsteno grabada químicamente, se calienta la platina del microscopio a 28 grados Celsius. Para minimizar la influencia de las fluctuaciones de temperatura al iniciar la disección retiniana, transfiera un embrión en una etapa de desarrollo específica a cinco mililitros de solución de Ringer en una placa de cultivo Falcon de 60 por 15 milímetros preparada como se describió para la disección retiniana sin EPOR, corte la cabeza y parte del tronco anterior utilizando rápidamente la punta afilada del fórceps para retirar el cuerpo del pez cebra. A continuación, sujete con una aguja el extremo posterior de la sección del tronco cefálico sobre la placa de cultivo. Con los fórceps auxiliares, abra la cabeza por el lado dorsal comenzando desde la frente anterior.

Retire el cerebro de manera que el lado medial de los ojos quede expuesto y orientado hacia arriba para manipulaciones posteriores. Para diseccionar la retina, utilice la punta de la pinza para cepillar cuidadosamente el epitelio pigmentario de la retina (RPE) expuesto en el lado medial del ojo orientado hacia arriba, hasta observar una pequeña abertura hacia la retina. Continúe con la acción de cepillado y desprendimiento hasta que el lado medial de la retina esté casi completamente expuesto.

Evite rayar y perforar la retina expuesta para la eliminación del EPR lateral en la retina del ojo orientado hacia el enfoque del plato de cultivo. Mantenga un ángulo de aproximadamente 45 grados con respecto a la superficie de la placa de cultivo y cepille el ojo con la pinza. Retire el EPR que está adherido relativamente con firmeza a la ora serrata fijando la porción desprendida del EPR a la placa de cultivo para la disección.

Luego, levante suavemente la retina para limpiar el epitelio pigmentario retiniano residual y retire el cristalino utilizando la propiedad adhesiva del recipiente de cultivo. Tenga cuidado de no dañar las células retinianas, que también se adhieren ligeramente a la superficie del recipiente. Si el cristalino no se desprende con el movimiento de rodado, utilice una aguja de tungsteno grabada con un movimiento circular sobre la superficie del cristalino.

Para comenzar la disección retiniana con epitelio pigmentario de la retina (RPE) adherido, utilice una placa de cultivo Falcon de 60 por 15 milímetros preparada según se describió para una disección retiniana con RPE adherido. Transfiera un embrión en una etapa de desarrollo específica a cinco mililitros de solución de Ringer. Corte la cabeza y parte del tronco anterior.

Retirar rápidamente el cuerpo del pez cebra como se hizo anteriormente. Fijar el extremo posterior de la sección del tronco cefálico en una placa de cultivo. Con la ayuda de las pinzas, abrir la cabeza por el lado dorsal comenzando desde la frente anterior.

Extraiga el cerebro de manera que el lado medial de los ojos quede expuesto y orientado hacia arriba. Para manipulaciones posteriores con pinzas, levante suavemente el ojo desde el lado lateral posterior y rótelo hacia el lado anterior. La coroides y el tejido escleral en la parte externa de la capa de epitelio pigmentario de la retina (RPE) están relativamente adheridos con firmeza a la piel y pueden eliminarse en su mayor parte al rotar cuidadosamente el ojo hacia el lado anterior.

Retire el cristalino con la aguja de tungsteno después de exponer el lado lateral del ojo y mientras el ojo aún esté unido a la piel para la disección retiniana. Sin el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y con la retina con RPE adherido, las muestras diseccionadas pueden recolectarse en triol en un tubo micro de RNA para análisis posteriores. Caracterización de RNA.

Se muestra aquí una disección retiniana exitosa sin epitelio pigmentario retiniano (RPE), en la que se mantiene la integridad retiniana, como lo indica la superficie intacta de la retina. La sección histológica correspondiente también muestra que la arquitectura retiniana se conserva muy bien. En particular, la preservación de la matriz extracelular entre la capa de fotorreceptores y el RPE es excepcionalmente buena.

Un éxito en la disección de retina con epitelio pigmentario de la retina (RPE) adherido se evidencia por una capa de RPE intacta y continua. La sección histológica correspondiente muestra que tanto las células retinianas como las del RPE se encuentran en buen estado. El ARN total extraído de las retinas diseccionadas es de alta calidad.

Esto se indica mediante el electroferograma y la imagen del gel obtenidos del análisis con el bioanalizador. La línea base es plana y los picos ribosomales de 18 s y 28 s están intactos. El número de integridad del ARN generalmente es mayor que 9,8.

Acabamos de mostrarle los procedimientos de microdisección para obtener la retina embrionaria de pez cebra con y sin EPR. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los pasos más críticos en la disección retiniana son el movimiento de cepillado con la punta de las pinzas y el enrollado del tejido. Para la eliminación de restos de EPR, descubrimos que apoyar los codos sobre el reposabrazos ajustable de la silla durante la disección puede estabilizar considerablemente los movimientos de la mano.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.