Name: Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende microdisección de retina y epitelio pigmentario retiniano en embriones de pez cebra de uno a tres días post-fertilización. Esta técnica permite aislar tejidos intactos para estudiar perfiles de expresión de ARN específicos del tejido.

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Este trabajo es apoyado por un fondo de arranque desde el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Purdue.

Parte 1: Preparativos antes de microdisección <ol><li> Soluciones <ol class="lalpha"><li> E3 medio 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 y 0,33 mM MgSO 4). </li><li> Solución de Ringer 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7.2), esterilizado por filtración. </li><li> NaOH 5N. </li></ol></li><li> Ataque químico de las agujas de tungsteno <ol class="lalpha"><li> Asegurar un pequeño vaso que contiene NaOH 5 N en una placa de Petri de arcilla. </li><li> Adjuntar un clip de papel en el lado del vaso, por lo que entra en contacto con la solución de NaOH. </li><li> Conecte el electrodo negativo de una fuente de alimentación de CC en el clip y el electrodo positivo a un extremo de una pieza corta (~ 2 cm) de alambre de tungsteno. </li><li> Envuelva el otro extremo del alambre de tungsteno con una bola de arcilla y sumergir este extremo en la solución de NaOH. </li><li> Aumentar la tensión a unos 3V y sumergir el hilo hacia arriba y abajo en la solución de NaOH hasta una velocidad de grabado bien se alcanza. Una aguja en buena calidad por lo general puede ser grabada en 10 minutos. </li><li> El alambre de tungsteno expuesta a la disolución se volverá gradualmente más delgada. Cuando la bola de arcilla cae, el otro lado del alambre que está todavía en el electrodo positivo tendrá una forma aguja. </li><li> Enjuague la aguja con solución de Ringer o E3 para eliminar los depósitos de sal. </li><li> Ponga la aguja en un aplicador de madera con una cinta o un soporte de aguja para un fácil manejo. </li></ol></li><li> Placas de cultivo <ol class="lalpha"><li> El Falcon 60 x 15 mm y placas de cultivo de poliestireno están listos para usar para la microdisección de retina. </li><li> Para la disección de RPE-adjunto retina, aplastar a dos embriones por completo en una placa de cultivo con solución de Ringer para deshacerse de la adherencia de la superficie de 30 minutos antes de la disección. Poco antes de la disección, se lava la placa extensamente con solución de Ringer fresca. </li></ol></li><li> Los embriones de recogida y puesta en escena <ol class="lalpha"><li> Adultos de pez cebra se mantienen tal como se describe 4, 5. </li><li> Separar los peces de los padres en los tanques de cría estática pares por un divisor de la noche antes de la reproducción. </li><li> Quitar el divisor después de la luz de la habitación se enciende en la mañana siguiente. Permiten que los padres se cruzan en intervalos de 10 minutos cada media hora. Separar el pescado después de cada cruce. </li><li> Mantener los embriones obtenidos de cada cruce en el medio de E3 por separado a 28 ° C. </li><li> Embriones etapa de 10 a 12 horas después de la fecundación (HPF) y re-escenificar inmediatamente antes de la disección en los puntos de tiempo específicos, de acuerdo con los criterios establecidos 1, 6. </li></ol></li></ol> Parte 2: Disección - la extracción del cerebro y una exposición de los ojos <ul><li> Los procedimientos descritos en esta sección son comunes para la disección de la retina (la parte 3A) y RPE-adjunto retina (parte 3 B). </li><li> Todas las disecciones bien se realiza por un extremo de la pinza Dumont y con la asistencia de otro par de pinzas Dumont para el posicionamiento del tejido. Una aguja de tungsteno químicamente grabados se pueden utilizar para la manipulación más fina si es necesario. </li><li> Todas las disecciones bien se llevan a cabo con un aumento de ~ 5-8x en una Olympus SZX16 microscopio equipado con un objetivo 1X o equivalente. </li><li> Mantener los embriones en un medio de E3 en una mesa de laboratorio incubadora a 28 ° C al lado del microscopio para el acceso fácil embrión durante la disección. </li><li> La platina del microscopio se calienta a 28 ° C con una placa térmica para reducir al mínimo la influencia de la fluctuación de la temperatura sobre la expresión génica. </li></ul><ol><li> La transferencia de un embrión en una etapa de desarrollo específicas para la solución de Ringer en un Falcon 60 X 15 mm placa de cultivo preparado como se describe en la Parte 1 # 3. </li><li> Le cortó la cabeza con la parte del tronco anterior rápidamente del cuerpo. </li><li> Pin el extremo posterior de este tejido en la placa de cultivo con las pinzas de la asistencia. </li><li> Abrir la cabeza en la parte dorsal a partir de la frente anterior. </li><li> Retire el cerebro de manera que la cara medial de los ojos está expuesto y es hacia arriba para otras manipulaciones. </li></ol> Parte 3A: la disección de una retina <ol><li> Preparar el embrión como se describe en la Parte 2. </li><li> Con cuidado, cepillo de la RPE expuestos en la parte media del globo ocular que es hacia arriba por la punta de la pinza hasta que una pequeña abertura en la retina se ve. </li><li> Continuar con el cepillado y el peeling de acción hasta el lado medial de la retina es casi todo lo expuesto. Evitar arañazos y golpes en la retina expuestos. </li><li> Para quitar el RPE lateral en la retina que se enfrenta ahora a la baja, el enfoque y el cepillo que en un ángulo de aproximadamente 45 ° de la superficie de la placa de cultivo. </li><li> Quitar el EPR que se adjunta relativamente firme a la ora serrata fijando la porción desprendida del EPR a la cultura placa para la disección, y luego levante suavemente la retina. </li><li> Rollo de la retina en la parte inferior de la placa de cultivo para limpiar el RPE residual. <ol class="lalpha"><li> Nos hemos dado cuenta de que este especial de poliestireno Falcon placa de cultivo tiene una adherencia preferencial de RPE durante aproximadamente 20 minutos una vez que un embrión es aplastado. Esta propiedad se utiliza para la eliminación de los restos de RPE. Sin embargo, las células de la retina se adhieren a la superficie, en menor medida, lo que puede ser inspeccionado de cerca con una lupa de alta. Uno tiene que encontrar un equilibrio entre la integridad de la eliminación del EPR y la integridad de la retina. </li><li> La lente con frecuencia se adhiere a la placa de cultivo y se separa de la retina durante el proceso de laminación. En ocasiones, es necesario separar la lente de una aguja de tungsteno grabado con una acción de remolino en la superficie de la lente. </li></ol></li><li> Estos procedimientos pueden eliminar con éxito RPE de la retina sin comprometer la integridad de los tejidos. Esto se indica mediante una buena morfología general (Figura 1 B y B ') y la histología (Figura 1 B "), la flecha, en particular, la preservación de la matriz extracelular entre la capa de fotorreceptores y RPE es excepcional (fig. 1B."; compara con la histología de todo el embrión (Figura 1 ")). </li></ol> 3B parte: RPE-adjunto disección de la retina 3 <ol><li> Preparar el embrión como se describe en la Parte 2. </li><li> Pin de la cabeza a la placa de cultivo por las pinzas de asistente. Levantar los ojos suavemente desde la parte lateral y posterior despliegue de la cara anterior. <ol class="lalpha"><li> La coroides y presunto tejido escleral en el exterior de la capa de RPE se unen relativamente bien a la piel y puede ser en su mayoría se quitó rodando los ojos con cuidado para la cara anterior. </li></ol></li><li> Retire el objetivo con una aguja de tungsteno después de la parte lateral del ojo está expuesta y cuando el ojo está aún en la piel. </li><li> Estos procedimientos con éxito puede preservar la capa de RPE conjunto con la retina. Coroides presuntivo y tejido escleral puede ser retirado en gran parte (Figura 1 C, "C y C"). </li></ol> Parte 4: recolección de muestras de tejido para el trabajo de ARN <ol><li> Las muestras disecadas se pueden recoger en TRIzol en un tubo de microcentrífuga de RNasa libre para abajo caracterización de ARN como se describe antes del 1. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) y lateral (A) vista dorsal de una cabeza de larvas de pez cebra a las 52 HPF antes de la disección. (A ") El apartado correspondiente histológico de la cabeza de larvas en (A) y (A '). (B) y lateral (B) vista dorsal de la retina diseccionado en 54 HPF. La superficie de la retina estaba intacto, tanto lateral y puntos de vista dorsal. (B ") En la sección correspondiente histológico de la retina disecado en (B) y (B '). La estructura de la retina y la retina de laminación estaba intacto. En particular, la matriz extracelular entre la capa de fotorreceptores y RPE (A ", las flechas) estaba bien conservado en la retina disecados (B", las flechas). (C) y lateral (C ') vista medial de la disección RPE-adjunto retina en 52 HPF. RPE capa estaba intacto y continuo, que también se indica por el corte histológico de los tejidos disecados (C "). El área blanca en C 'es el nervio óptico (flecha). Por histología, las muestras de tejido fueron recogidos y fijados en el 4% paraformaldehído. plástico inclusión y corte de estas muestras se realizaron como se describe 3. Barra de escala = 50 micras.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por Cuidado de Animales de Purdue y el empleo.

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra puede efectivamente obtener la retina intacta y las retinas de RPE-adjunto. Esto ayuda considerablemente los estudios de expresión pertenecientes a un tejido ocular específico (es decir, la retina o RPE). De hecho, hemos utilizado con éxito estos procedimientos para obtener los perfiles de expresión de ARN de toda la retina y el EPR 1 3. La utilidad de estos perfiles es apoyado fuertemente por nuestra reciente identificación de las vías y las familias de gene...

<table><tbody><tr><td>Motor de pistilo inalámbrico</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de corriente continua</td><td>Lascar</td><td>PSU130</td><td>Cualquier fuente de alimentación de corriente continua funcionará. El voltaje específico de una máquina diferente requerirá una optimización adicional.</td></tr><tr><td>Pestillo desechable &amp;y microtubo, 1,5 mL (libre de DNasa, RNasa y pirogénos)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>Estos se utilizan para la recolección de tejidos en TRIzol para análisis de expresión.</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5, puntas: 0,05 x 0,01 mm, acero inoxidable</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>La dimensión de la punta fina es deseable pero no inflexible, ya que puede ser necesario afilar la punta de vez en cuando.</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5SF, puntas: 0,025 x 0,005 mm, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>La dimensión de la punta fina es deseable pero no inflexible, ya que puede ser necesario afilar la punta de vez en cuando.</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de poliestireno Falcon, 60 x 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>Estas placas se utilizan como placas de disección.</td></tr><tr><td>Olympus SZX16 Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>Cualquier estereomicroscopio funcionaría. En estudios previos utilizamos un estereomicroscopio Leica.&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; sin ningún problema. También utilizamos exclusivamente el objetivo de 1X para la disección, aunque tenemos instalado un objetivo de 2X. </td></tr><tr><td>Piedra de afilar</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>Úsese para afilar la punta de la pinza si es necesario</td></tr><tr><td>placa térmica</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>Esto se utiliza para mantener la temperatura del tejido durante la disección y minimizar la influencia de las fluctuaciones térmicas sobre la expresión génica. También colocamos todo el microscopio en una habitación con condiciones ambientales controladas a 28&amp;#x00B0;C durante la disección en estudios previos&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; con buenos resultados.</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>alambre de tungsteno, diámetro de 0,015 pulgadas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de madera</td><td>Puritano</td><td>807</td><td>Esto se utiliza para sostener la aguja de tungsteno grabada químicamente.</td></tr></tbody></table>

microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Pez cebra es un modelo animal popular para la investigación sobre el desarrollo del ojo, debido a su rápida<em&gt; Ex utero</em&gt; El desarrollo y la fecundidad buena. A los 3 días después de la fertilización (dpf), las larvas se mostrará la primera respuesta visual. Muchos genes se han identificado para el control de un desarrollo adecuado de los ojos, pero estamos lejos de una comprensión completa de la arquitectura genética subyacente. Gen de todo el genoma de perfiles de expresión es una herramienta útil para dilucidar red de regulación genética para el desarrollo del ojo. Sin embargo, el pequeño tamaño del ojo de embriones de pez cebra hace que sea difícil obtener los tejidos del ojo intacto y puro para análisis de la expresión. Por ejemplo, la longitud antero-posterior del ojo, entre el día 2 y 3 es de sólo unos 200 a 300 micras, mientras que el diámetro de la lente es m menos de 100. Además, el epitelio pigmentario retiniano (EPR) que subyacen a la retina es un epitelio de una sola capa. Mientras que los perfiles de expresión genética se puede obtener de todo el embrión, que no representan con precisión la expresión de estos tejidos. Por lo tanto el tejido puro debe ser obtenido por un perfil de expresión génica con éxito el desarrollo del ojo. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un enfoque para microdissect retina intacta y la retina con el EPR adjunto de fdd 1-3, que abarcan las principales etapas de la morfogénesis del ojo. Todos los procedimientos se puede hacer con unas pinzas finas y suministros generales de laboratorio con microscopios estereoscópicos estándar. Para la disección de la retina, el EPR de una sola capa se elimina y se quitó el cepillo de acción y la adhesión preferencial de los restos del EPR a la superficie de la placa de cultivo para la disección. Para RPE-adjunta la disección de retina, la adhesión de RPE de la placa de la disección se produce antes de la disección a fin de que el EPR puede ser conservado en su totalidad con la retina. Una acción de elevación cuidadosa de este tejido permite la separación de la coroides y la esclerótica presunto. La lente se puede quitar en ambos casos por una aguja de tungsteno grabada químicamente. En resumen, nuestro enfoque puede obtener tejidos intactos los ojos y ha sido utilizado con éxito para el estudio de tejidos específicos perfiles de expresión de la retina del pez cebra<sup&gt; 1, 2</sup&gt; Y el epitelio pigmentario de la retina<sup&gt; 3</sup&gt;.

Este artículo describe un método para microdissect retinas del pez cebra con y sin epitelio pigmentario de la retina adjunta, de uno a tres embriones postfertilización días.

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

El pez cebra es un modelo animal popular para la investigación del desarrollo ocular debido a su rápido desarrollo ex utero y su buena fecundidad. Para el tercer día posterior a...

Este video muestra la microdisección de la retina y de la retina con pigmento retinal, epitelio, o EPR, adherido a embriones de pez cebra entre uno y tres días después de la fertilización. Todos los procedimientos pueden realizarse con pinzas finas y materiales de laboratorio comunes. Bajo microscopios estereoscópicos estándar para la disección retinal, la capa simple de EPR se elimina y desprende mediante una acción de cepillado y la adherencia del EPR a la superficie de la placa de cultivo.Para la disección de retina con epitelio pigmentario retiniano (RPE) adherido, las propiedades adhesivas de la placa de cultivo se eliminan mediante trituración embrionaria y lavado previo a la disección. Para preservar intacto el RPE, un levantamiento cuidadoso de este tejido separa eficientemente la coroides y la esclerótica del retina con RPE adherido, seguido de la eliminación del cristalino utilizando una aguja de tungsteno grabada químicamente. Este método de disección permite obtener tejidos de retina intactos y ha sido utilizado con éxito para estudiar la expresión específica de ARN y los perfiles del retina y del epitelio pigmentario retiniano de pez cebra.Hola, soy Li Jang del laborat

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Investigación

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Biología

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Lente del desarrollo implica interacciones con otros tejidos. Varios mutantes ojo de pez cebra se caracteriza por un tamaño anormalmente pequeño lente. Aquí se demuestra un experimento de trasplante de lentes para determinar si este fenotipo se debe a causas intrínsecas o interacciones defectuosas con los tejidos que rodean a la lente.

Trasplante de lentes en el pez cebra y su aplicación en el análisis de mutantes de ojos

Este video describe el protocolo que se desarrolla para diseccionar lentes de pez cebra adultos y larvales para analizar la morfología cortical del cristalino y la integridad estructural de las suturas del cristalino.

Disección del cristalino del ojo: una técnica para observar la morfología del cristalino del pez cebra

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz es una excelente herramienta para obtener imágenes del desarrollo embrionario. Permite la grabación de vídeos de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas. Demostramos su aplicación para obtener imágenes del desarrollo del ojo del pez cebra a través de amplias escalas espacio-temporales y presentamos una línea para la fusión y deconvolución de conjuntos de datos multivista.

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener resultados de localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra por microscopía de superresolución la correlación y análisis de imágenes de microscopia electrónica.

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

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Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Aquí, se proporciona un protocolo para imágenes de lapso de tiempo de la morfogénesis ocular utilizando un microscopio de hoja de luz disponible comercialmente y una estación de trabajo de procesamiento de imágenes para analizar los datos resultantes. Este protocolo detalla los procedimientos para la anestesia embrionaria, la incrustación en agarosa a baja temperatura de fusión, la suspensión en la cámara de imágenes, la configuración de los parámetros de imagen y, finalmente, el análisis de...

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