JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 5:11 min • April 30th, 2023
- Los organoides son diminutos cultivos celulares tridimensionales derivados de células madre específicas de tejidos. Son genómicamente estables pero modificables genéticamente a través de la transfección y, por lo tanto, ideales para la investigación genética. Para la transfección, siembre los organoides en una placa de cultivo multipocillo con un medio de cultivo específico e incube durante el tiempo deseado. A continuación, agregue una mezcla de disociación a la placa para ayudar a la disociación de las células organoides. Transfiera la mezcla a un tubo y centrifuga. Vuelva a suspender el gránulo de organoide en un tampón de electroporación que contenga ADN plasmídico marcado con fluorescencia. El tampón estabiliza las células y evita la muerte celular debido al estrés eléctrico.
Transfiera la mezcla a una cubeta y electropore las celdas. Los impulsos eléctricos a través de la membrana celular dan como resultado la formación temporal de poros para facilitar la absorción de ADN plasmídico en la célula. Después de la electroporación, agregue inmediatamente el medio de cultivo a la suspensión celular y transfiera la mezcla a un tubo. Ahora, centrifuga las células. Vuelva a suspender el pellet en la matriz del basamento y transfiéralo a la placa multipocillo para la polimerización. Coloque la placa bajo un microscopio fluorescente y verifique la fluorescencia en las células, lo que confirma la transfección eficiente. En el siguiente protocolo, realizaremos la electroporación para transfectar organoides gastrointestinales.
- Comience precalentando placas de 48 pocillos a 37 grados Celsius para la siembra posterior a la electroporación, luego prepare medios basales y organoides específicos para el cultivo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cultive cinco pocillos de organoides por muestra de electroporación en una placa de 48 pocillos. Prepare 230 microlitros de reactivo de disociación con 10 micromolares Y27632 por pocillo. Monitoree los organoides bajo un microscopio. Retire el medio de cultivo de los pocillos y disocie los organoides mecánicamente en la mezcla de disociación preparada. Agrupe cinco pocillos por muestra de electroporación en un tubo de 15 mililitros.
Mezclar el contenido del tubo por vórtice e incubarlo durante 5 a 15 minutos a 37 grados centígrados hasta que se formen grupos de 10 a 15 células, comprobando la disociación con el microscopio. Detenga la digestión agregando hasta 10 mililitros de medio basal sin antibióticos. Centrifugar el tubo a 450 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave las células dos veces con 4 mililitros de tampón de electroporación. Centrifugar y desechar el sobrenadante después de cada lavado. Después de los lavados, vuelva a suspender el pellet del organoide en 100 microlitros de tampón de electroporación con 30 microgramos de ADN plasmídico.
Dispense la mezcla completa de ADN y organoides en una cubeta de electroporación. Asegúrate de evitar las burbujas de aire. Configure los parámetros de electroporación como se describe en el manuscrito de texto y golpee la cubeta con un dedo para mezclar suavemente las celdas. Coloque la cubeta en la cámara de la cubeta y presione el botón de impedancia en el electroporador para anotar el valor de impedancia. Presione el botón Inicio para iniciar el programa de electroporación y controlar los valores de las corrientes, voltajes y energías mostrados.
Después de la electroporación, agregue inmediatamente 500 microlitros de medio de cultivo sin antibióticos a las células y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la muestra a un nuevo tubo de 15 mililitros y enjuague la cubeta con medio basal para recolectar las células restantes, luego incube las células a temperatura ambiente durante 40 minutos. Centrifugar las células a 450 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de matriz basal y siembre gotas de 20 microlitros en una placa precalentada de 48 pocillos.
Incubar la placa durante 10 minutos a 37 grados centígrados para polimerización y agregar 250 microlitros de medio de cultivo suplementado con Y27632 y CHIR-99021 por pocillo. Para determinar la eficiencia de la transfección, verifique la fluorescencia en el control de transfección bajo el microscopio después de 24 a 48 horas.