Imágenes de la dinámica del calcio en las células pancreáticas: una técnica para estudiar los cambios en tiempo real en la concentración de calcio citosólico en los islotes pancreáticos

- Los islotes pancreáticos son un grupo de células pancreáticas productoras de hormonas que desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. La concentración elevada de glucosa desencadena el cierre de los canales de iones de potasio, evitando el flujo de iones de potasio, lo que conduce a la despolarización de la membrana. En consecuencia, los canales de iones de calcio dependientes del voltaje se abren, permitiendo la entrada de iones de calcio. Este aumento de la concentración de calcio citosólico estimula la liberación de hormonas como la insulina. En tiempo real, para obtener imágenes de la dinámica citosólica del calcio, transfiera algunos islotes cargados con un tinte indicador de calcio adecuado entre las paredes espaciadoras de una malla fina preensamblada.

Coloque la malla boca abajo en un cubreobjetos colocado dentro de la cámara de imágenes de un microscopio invertido. Coloque una malla gruesa y un peso para inmovilizar las células. Agregue solución de imagen en la cámara. A continuación, configure un sistema de perfusión para introducir glucosa o una hormona de prueba de interés. Dentro de las células, los indicadores de calcio fluorescentes precargados informan de cualquier aumento en las concentraciones de calcio citosólico. Al unirse a los iones de calcio, las moléculas indicadoras exhiben un aumento sustancial en la emisión de fluorescencia. En el siguiente protocolo, mostraremos la imagen en tiempo real de la dinámica del calcio en los islotes pancreáticos murinos en respuesta a la perfusión de glucosa.

- Para inmovilizar los islotes para la obtención de imágenes, ensamble una cámara de imágenes para un microscopio invertido y coloque un cubreobjetos de vidrio dentro de la cámara. Asegúrese de que la interfaz de la cámara de vidrio sea hermética y confirme que el cubreobjetos esté al alcance del objetivo del microscopio. A continuación, corte cuadrados de 20 X 20 milímetros de malla fina y gruesa y use trozos de 45 a 50 micrómetros de cinta adhesiva gruesa para crear dos paredes espaciadoras en un trozo de malla fina. Sumerja la malla gruesa y un peso en una placa de Petri de 35 milímetros de solución de imagen y coloque la malla fina bajo un microscopio de disección.

Gire la malla fina con las paredes del espaciador al revés y los espaciadores hacia arriba y utilice una pipeta P20 para transferir varios islotes entre los dos espaciadores. Con pinzas de relojero, coloque la malla boca abajo dentro de la cámara de imágenes del microscopio invertido de modo que los espaciadores miren hacia abajo para asentarse directamente sobre el cubreobjetos de la cámara, atrapando los islotes entre los espaciadores y la malla en el centro del cubreobjetos.

- Tenga cuidado de que la malla esté bien hidratada sin contener volúmenes excesivos de solución, lo que provocaría el movimiento lateral de la muestra.

- Luego, coloque la malla gruesa y el peso encima de la malla fina en la cámara y agregue solución de imagen a la cámara. Una vez que se hayan inmovilizado los islotes, seleccione el modo de imagen y el objetivo en el microscopio invertido y coloque la cámara con los islotes en la platina de temperatura controlada del microscopio. Después de configurar la perifusión, coloque el flujo de entrada más bajo que el flujo de salida dentro de la cámara y configure el flujo de salida para que sea mayor que el flujo de entrada.

Asegúrese de que el flujo de salida tenga un contacto mínimo con la solución para que elimine la solución en múltiples gotas pequeñas secuenciales de espera largos intervalos de eliminación continua de la solución. A continuación, inicie la perifusión con una solución de imagen que contenga 3 milimolares de glucosa y seleccione la trayectoria de la luz y los filtros para obtener imágenes de fluoróforos verdes. A continuación, ejecute imágenes en directo para configurar los parámetros de imagen y ajustar la vista para capturar los islotes de interés.

Para optimizar la relación señal-ruido de la imagen, ajuste la intensidad de la luz de excitación, el tiempo de exposición y el agrupamiento, asegurándose de que la configuración permita una visualización distinta de cada celda dentro de los islotes con la mínima intensidad de luz y exposición posibles. A continuación, obtenga una imagen de los islotes a una temperatura de 0,1 a 5 hercios, comprobando la calidad de los datos adquiridos a medida que se capturan.