Aislamiento primario de células acinares: un método para aislar células acinares del páncreas de ratón

- Una célula acinar pancreática es una célula exocrina que contiene una variedad de enzimas digestivas. A veces, en respuesta a la señalización oncogénica, la célula acinar se convierte en una célula ductal. Esta célula ductal puede convertirse posteriormente en cancerosa. Por lo tanto, es vital aislar las células acinares para estudiar su papel en la progresión del cáncer de páncreas.

Comience por aislar el páncreas de un ratón sacrificado. Agregue el páncreas a un bote de pesaje que contiene una solución salina equilibrada suplementada con un antibiótico. Pica el páncreas en pedazos pequeños con unas tijeras y agrega el tejido pancreático a un tubo. A continuación, agregue la solución de colagenasa a los trozos de páncreas en el tubo.

La colagenasa digiere el colágeno que mantiene unido el tejido para que el tejido se rompa en pedazos finos. Ahora, agregue medios que contengan suero al tubo y coloque el pañuelo sobre hielo. Esto ayuda a detener la acción de la colagenasa.

Filtre el tejido y el medio dos veces, disminuyendo progresivamente el tamaño de la malla del filtro cada vez para obtener una suspensión de tejido fino. Finalmente, centrifugar la suspensión resultante para recoger las células acinares en el pellet. Retire el sobrenadante y almacene las células acinares para su posterior análisis. En el siguiente protocolo, aislaremos células acinares del páncreas de un ratón sacrificado.

- Para diseccionar el páncreas de un ratón sacrificado, primero sujete las patas del ratón a la tapa de poliestireno, orientándola de modo que la cola quede frente al investigador, y rocíe el abdomen con etanol al 70%. Use pinzas esterilizadas en autoclave para levantar el pelaje y la piel en la línea media, y con unas tijeras esterilizadas en autoclave, haga una incisión a través del pelaje y la piel desde la abertura uretral hasta el área del diafragma y la caja torácica. Haz incisiones adicionales a la izquierda y a la derecha para cortar el pelaje y la piel, creando una vista clara de la cavidad abdominal.

Luego, corte el revestimiento peritoneal por la mitad y hacia la derecha y la izquierda, y retírelo de los órganos. Use las pinzas para levantar los intestinos y moverlos hacia el lado izquierdo del ratón, creando espacio para ver el páncreas de color rosa claro unido al bazo ovalado de color rojo oscuro. El tejido pancreático tendrá una textura suave y esponjosa. Corta el páncreas, que corre a lo largo del estómago y se entrelaza con los intestinos.

Separe el bazo del páncreas y coloque el páncreas en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS con 1X penicilina-estreptomicina y transfiéralo a la campana de flujo laminar. Vierta el contenido del tubo en un recipiente de pesaje vacío y use pinzas para lavar el páncreas girándolo. A continuación, utilice las pinzas para trasladar el páncreas a un segundo recipiente de pesaje que contenga HBSS con penicilina-estreptomicina y vuelva a lavar con remolino.

Mueva el páncreas al tercer recipiente de pesaje que contiene HBSS con penicilina-estreptomicina y comience a cortar el páncreas en trozos de 5 milímetros o más pequeños. Para verter el contenido del bote de pesaje en un tubo nuevo de 50 mililitros, primero use las pinzas para mover las piezas del páncreas en el líquido a medida que se inclina el bote. Una vez que las piezas ya no estén unidas al bote, vierta su contenido en el tubo. Recoja las piezas restantes con las pinzas y lave las pinzas en el tubo.

Después de centrifugar el tubo a 931 veces la gravedad a 4 grados centígrados durante dos minutos, utilice una pipeta de 5 mililitros para eliminar el HBSS y la grasa flotante. Añadir 5 mililitros de colagenasa diluida en HBSS. Cierre el tubo y asegúrese de que la tapa esté sellada envolviendo el tubo en una película plástica de parafina. Colóquelo en una incubadora, agitando a 220 RPM a 37 grados centígrados durante 20 minutos, lo que producirá una solución turbia y pocos trozos de tejido restantes.

Para detener la disociación, coloque el tubo sobre hielo y agregue 5 mililitros de HBSS frío con 5% de FBS. Después de centrifugar a 931 veces la gravedad a 4 grados centígrados durante dos minutos, retire el sobrenadante con una pipeta de 5 mililitros. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de HBSS con 5% de FBS y vuelva a centrifugar a 931 veces la gravedad durante dos minutos a 4 grados centígrados.

Retire el sobrenadante con una pipeta de 5 mililitros y repita este paso con otros 10 mililitros de HBSS con 5% de FBS. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 5 mililitros de HBSS con 5% de FBS. Utilice una pipeta P1000 para filtrar la suspensión celular de 1 mililitro a la vez a través de una malla de 500 micrómetros en un tubo de 50 mililitros.

Para lavar las células pancreáticas restantes a través de la malla, agregue 5 mililitros adicionales de HBSS con 5% de FBS. A continuación, utilice una pipeta P1000 para pasar este filtrado de 1 mililitro a la vez a través de la malla de 105 micrómetros hasta un tubo de 50 mililitros. Pipetea suavemente esta suspensión celular en un tubo de 50 mililitros que contiene HBSS con 30% de FBS, lo que formará una capa de suspensión celular en la parte superior.

Centrifugar esta suspensión celular a 233 veces la gravedad a 4 grados centígrados durante dos minutos y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet que contiene las células acinares en el medio completo de 1X Waymouth.