Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

- Las células de los islotes del páncreas producen hormonas esenciales implicadas en las funciones endocrinas. Para aislar los islotes, primero, asegure un ratón sacrificado y exponga quirúrgicamente su cavidad abdominal. Cepille el hígado y los intestinos para localizar y pinzar el conducto biliar común. Identificar la ampolla de Vater, el conducto formado por la unión de los conductos pancreáticos y biliares comunes.

A continuación, inyecte una solución de enzima colagenasa en el conducto biliar común. El reflujo del conducto infla con éxito el páncreas, lo que facilita la disociación de los tejidos pancreáticos inducida por la colagenasa. Extirpe el páncreas en un tubo que contenga más solución de colagenasa. Picar mecánicamente el tejido e incubarlo para ayudar a la digestión del tejido por la colagenasa.

Una vez obtenida una suspensión homogénea, se detiene la digestión enzimática añadiendo una solución que contenga proteínas que inhiban la actividad de la colagenasa. Centrífuga para recoger una bolita de tejido. Vuelva a suspender el pellet en un medio de gradiente de densidad adecuado, coloque una capa de tampón adecuado sobre él y centrifugue para generar capas de gradiente.

Recoja islotes de la capa formada entre el medio de gradiente de densidad y la zona de influencia. Por último, elige islotes sanos para cultivar. En el siguiente protocolo, demostraremos el aislamiento de islotes pancreáticos murinos mediante la administración de colagenasa seguida de centrifugación en gradiente de densidad.

- Comience pegando las extremidades del ratón en posición supina y rociando el cuerpo con etanol al 70%. Con pinzas de cubreobjetos y tijeras quirúrgicas curvas, haga una incisión horizontal de aproximadamente 3 centímetros en la piel abdominal y abra la piel para exponer la pared abdominal. Haga una incisión vertical de 3 a 4 centímetros en el peritoneo abdominal para exponer completamente el páncreas y coloque al ratón bajo un microscopio de disección.

Empuje el lóbulo hepático superiormente para exponer el conducto biliar, que aparece como un tubo de color rosa pálido, y mueva suavemente los intestinos desde la región lumbar e ilíaca derecha a la derecha de la cavidad abdominal para exponer el conducto biliar y la arteria hepática. Utilice Schwartz Micro Serrefines para pinzar cuidadosamente el conducto biliar común lo más cerca posible del hígado e identificar la ampolla de Vater, que se encuentra en la papila duodenal y se forma por la unión del conducto pancreático y el conducto biliar común.

Usando pinzas Micro Adson para tensar el conducto biliar común, inserte una aguja de media pulgada de calibre 30 unida a una jeringa de 3 mililitros que contiene 3 mililitros de solución de colagenasa P recién preparada en la ampolla de Vater, empujando la aguja hacia el conducto paralelo al vaso durante aproximadamente un cuarto de la longitud del vaso. Una vez que la aguja esté en su lugar, estabilice la aguja con pinzas Micro Adson e inyecte lenta y constantemente 3 mililitros de solución de colagenasa P en el conducto. La inyección se considera exitosa si las regiones de la cabeza, el cuello, el cuerpo y la cola del páncreas están completamente infladas.

- La entrada adecuada en la ampolla y la canulación del conducto biliar común son fundamentales para una cosecha exitosa de la digestión. La perforación de las paredes ductales reduce la eficacia del aislamiento.

- Con pinzas curvas y Micro Adson, extraiga con cuidado el páncreas inflado comenzando en el bazo y continuando hacia el estómago y a lo largo del duodeno. A continuación, coloque el páncreas en un tubo de digestión de 50 mililitros que contenga 3 mililitros de solución helada de colagenasa P. Para recolectar los islotes, primero, use unas tijeras quirúrgicas finas para picar el páncreas durante 3 a 5 segundos antes de colocar el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius a 100 a 120 rotaciones por minuto durante 12 a 13 minutos.

Al final de la incubación, agite suavemente el tubo durante unos 30 segundos para romper el tejido hasta que la solución sea homogénea, como lo confirman las partículas finas de tejido pancreático similares a la arena. Tan pronto como se digiera el tejido, coloque el tubo en hielo y agregue 40 mililitros de solución de parada helada para terminar la reacción enzimática. Después de interrumpir suavemente el pellet, centrifugar el tejido digestivo en una centrífuga de cubo oscilante seguida de dos centrifugaciones con 20 mililitros de solución de parada fresca por lavado.

Después del último lavado, vuelva a suspender el pellet en 40 mililitros de HBSS helado durante tres lavados adicionales, resuspendiendo el pellet en 5 mililitros de solución de gradiente de densidad a temperatura ambiente después del último lavado. Agite el tubo brevemente a baja velocidad hasta que la solución se homogeneice antes de agregar otros 5 mililitros de gradiente de densidad a temperatura ambiente al tubo. Ahora use una pipeta de 10 milímetros para agregar suave y lentamente 10 milímetros de HBSS a temperatura ambiente al tubo gota a gota para permitir la formación de un gradiente, y use una centrífuga de cubo oscilante para aislar las poblaciones celulares mediante la separación por gradiente de densidad.

Al final de la centrifugación, utilice una pipeta de 10 mililitros, prehumedecida con HBSS frío para recoger de 5 a 10 mililitros de la capa de islotes entre el gradiente de densidad y el HBSS. Transfiera los islotes a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de HBSS fresco y helado, y recoja las células por centrifugación en una centrífuga de cubo oscilante. Aspire cuidadosamente todos menos los últimos 3 mililitros del sobrenadante sin alterar el pellet, y lave los islotes al menos tres veces más con 20 mililitros de HBSS fresco por lavado.

Después del último lavado, reemplace el sobrenadante con 4 mililitros de medio RPMI 1640 a 37 grados centígrados y agite suavemente el tubo para desalojar el pellet. Vierta inmediatamente los islotes en una placa de Petri de 100 milímetros y lave el tubo con 5 mililitros de medio RPMI 1640 fresco para recoger los islotes restantes, agrupando el lavado con los otros islotes.

A continuación, utilice un microscopio de disección y una punta de pipeta de 20 microlitros para seleccionar islotes sanos, esféricos u oblongos, de color marrón dorado con una superficie lisa, de la placa de Petri para transferirlos a una nueva placa de Petri que contenga 10 mililitros de medio RPMI 1640 completo. Cuando se hayan recolectado todos los islotes, colóquelos en la incubadora estéril a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en aire humidificado durante la noche.