Tinción inmunofluorescente de esferoides: una técnica para analizar la expresión de esferoides para la expresión de antígenos intra y extracelulares

- Los esferoides son modelos tridimensionales de cultivo celular in vitro. Para la tinción inmunofluorescente, primero genere un cultivo de esferoides del tipo de célula requerido en una placa de pocillos múltiples. Con una micropipeta con una punta de orificio ancho, recoja los esferoides, teniendo cuidado de evitar rupturas debido a las fuerzas de cizallamiento.

A continuación, fije y permeabilice los esferoides para hacer permeables las células individuales. Ahora, incubar con una solución que contenga proteínas para bloquear los sitios de interacción de proteínas no específicos en la superficie celular. Trate los esferoides con un cóctel de anticuerpos primarios deseado. Incubar para que los anticuerpos se unan a las moléculas objetivo en la superficie celular.

A continuación, marque los esferoides con una solución de anticuerpos secundarios marcada con fluorescencia específica para los anticuerpos primarios. Por último, trate los esferoides con un colorante fluorescente adecuado de unión al ADN para teñir los núcleos celulares. Usando un microscopio de fluorescencia de barrido láser, obtenga imágenes de múltiples secciones transversales ópticas del esferoide en diferentes planos ópticos.

Las imágenes capturadas reflejan núcleos y antígenos de interés marcados con fluorescencia. Combine las pilas utilizando el software correspondiente para obtener la imagen compuesta final del esferoide 3D. En el siguiente protocolo, realizaremos la tinción inmunofluorescente de esferoides de fibroblastos pancreáticos y fibroblastos asociados al cáncer cultivados en presencia de un estimulante, TGF beta 1.

- Primero, corte el extremo de la punta de una pipeta para agrandar el orificio. Una vez finalizada la incubación, utilice esta punta de pipeta cortada para recoger los esferoides en un tubo de reacción de 1,5 mililitros, según la condición experimental o la proteína que se va a analizar. Centrifugar los esferoides a 1.000 veces g durante unos 30 a 60 segundos. Retire con cuidado el sobrenadante que contiene metilcelulosa mediante pipeteo, asegurándose de no alterar los esferoides granulados.

- Se debe tener especial cuidado al transferir los esferoides a los tubos de reacción. Asegúrese de no tener fuerzas de esfuerzo cortante cortando la punta. También es importante que recojas todos los esferoides. Durante el paso de lavado, asegúrese de no perder los esferoides por aspiración.

- Para lavar los esferoides a 50 microlitros de 1X PBS, centrifugar a 1.000 veces g durante 30 a 60 segundos, luego retire con cuidado el PBS pipeteando. Dependiendo de la proteína que se vaya a teñir, fije los esferoides con 50 microlitros de paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Lave los esferoides con PBS como se describió anteriormente. Permeabilizar las células con Triton X al 0,1% en PBS durante 4 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los esferoides en PBS tres veces, como se ha descrito anteriormente. Agregue PBS que contenga 5% de FBS y 2% de BSA a los esferoides e incube a temperatura ambiente durante una hora para bloquear los sitios de interacción de proteínas no específicos.

Ahora, incube los esferoides con 30 microlitros de anticuerpos primarios en PBS con 2,5% de FBS y 1% de BSA a 4 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave los esferoides en PBS tres veces como se describió anteriormente.

Después de esto, incubar los esferoides con 30 microlitros de anticuerpos secundarios en PBS con 2,5% de FBS y 1% de BSA a temperatura ambiente durante 90 minutos. Lave los esferoides en PBS tres veces como se describió anteriormente.

A continuación, incube las células con 30 microlitros de solución de tinción DAPI durante 4 minutos a temperatura ambiente. Lave los esferoides en PBS una vez como se describió anteriormente. Con una pipeta Pasteur de vidrio, coloque los esferoides en un portaobjetos de vidrio en una gota de PBS. Utilice un microscopio de barrido láser para obtener imágenes de los esferoides mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 10 veces. Tome diferentes secciones transversales ópticas del esferoide en diferentes planos ópticos de una pila Z.