Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 5:39 min. • April 30th, 2023
- Las células de cáncer de páncreas interactúan con los fibroblastos asociados al cáncer en el microambiente tumoral o TME. Estas interacciones modulan la actividad metabólica de las células cancerosas y afectan la progresión del cáncer.
Los esferoides son los agregados celulares que recapitulan el TME in vitro. Por lo tanto, podemos usar estos esferoides para probar los cambios en las funciones metabólicas del tumor mediante un ensayo de flujo extracelular. Este ensayo mide la concentración extracelular de oxígeno y protones para determinar el metabolismo aeróbico y glucolítico, respectivamente.
Comience por tomar esferoides 3D del tamaño adecuado fabricados mediante el cultivo conjunto de células de cáncer de páncreas con fibroblastos pancreáticos. Ahora, transfiera los esferoides a una placa de análisis de flujo y cúbrala con un cartucho sensor que contenga medicamentos de prueba. Ejecute el ensayo en un analizador de flujo extracelular.
El analizador de flujo inyecta neumáticamente los fármacos de prueba desde el cartucho del sensor a la placa de análisis en puntos de tiempo específicos. En respuesta a los fármacos de prueba, las células liberan protones y oxígeno en la microcámara de la placa y los fluoróforos presentes en la sonda del sensor miden estos niveles. Por último, utilizando un software adecuado, analice la funcionalidad de los esferoides.
En el siguiente protocolo, demostraremos un método para medir la función metabólica de las células tumorales pancreáticas presentes en esferoides 3D utilizando el ensayo de flujo extracelular.
El día antes del ensayo metabólico, hidrate el cartucho de la sonda con 200 microlitros de calibrador de ensayo por pocillo en la placa de utilidad provista e incube la placa de utilidad durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius sin CO2.
A la mañana siguiente, observe los esferoides en la placa de crecimiento bajo un microscopio óptico para verificar su morfología y uniformidad general. Transfiera la placa de crecimiento a una unidad de retención magnética y aspire cuidadosamente aproximadamente 120 microlitros de medio de crecimiento por pocillo.
Lave suavemente los esferoides con 120 microlitros de medio de ensayo calentado tres veces. Después del último lavado, inspeccione los esferoides bajo el microscopio nuevamente para confirmar que los esferoides no se lavaron y agregue 180 microlitros de medio de ensayo tibio a cada pocillo.
Use una punta ancha y perforada para aspirar cuidadosamente un solo esferoide prelavado de la placa de crecimiento repelente de células y transfiera suavemente el esferoide directamente al centro de un pocillo de una placa de ensayo de esferoide, permitiendo que el esferoide caiga en la microcámara central del pocillo por gravedad.
Cuando se hayan transferido todos los esferoides, coloque la placa de ensayo en la incubadora de aire humidificado sin CO2 a 37 grados Celsius durante una hora. Durante la incubación, oriente el cartucho sensor de modo que las filas de la A a la H queden en el lado izquierdo y coloque una guía de carga en la parte superior del cartucho de modo que la letra correspondiente al puerto a cargar esté en la esquina superior izquierda.
Si la placa se ha cargado uniformemente, abra el software de análisis y haga clic en Plantillas. Haga doble clic en Plantilla en blanco y haga clic en Generar grupos. En la pestaña Mapa de placas, asigne grupos a la placa de ensayo correspondiente al diseño experimental y seleccione los cuatro pozos de las esquinas como pozos de fondo.
En la pestaña Protocolo de instrumento, marque Calibrar, Equilibrar y Ciclo de mediciones de referencia. Haga clic en Inyecciones y defina el compuesto para cada puerto. Cambie los ciclos de medición a 6. Revise el resumen de protocolo y grupo y, a continuación, guarde la plantilla de diseño de ensayo.
Basándose en el diseño del ensayo como guía, utilice una pipeta multicanal para dispensar cada reactivo directamente en los puertos de inyección, sujetando las guías de carga en su lugar con las yemas de los dedos. Cuando se hayan cargado todos los reactivos, retire la guía de carga y sostenga el cartucho a la altura de los ojos para inspeccionar visualmente los puertos de inyección y ver si la carga es uniforme.
Transfiera el cartucho y la placa de utilidad al analizador de flujo extracelular e inicie la calibración previa al ensayo. Una vez calibrado, reemplace la placa de utilidad con la placa de ensayo precalentada que contiene los esferoides 3D y comience el ensayo. Una vez finalizado el ensayo, exporte los datos al software de análisis de datos adecuado.