Modelo de ratón ortotópico fluorescente: implantación de células cancerosas que expresan GFP en ratones para evaluar la progresión tumoral in vivo

- Las células cancerosas que expresan proteína fluorescente verde o GFP permiten monitorizar el crecimiento tumoral y la metástasis mediante imágenes ópticas no invasivas. Por lo general, implantamos estas células en un modelo ortotópico, que permite la recreación del microambiente tumoral e imita la interacción de las células tumorales con su entorno.

Comience colocando un ratón anestesiado sobre una almohadilla térmica tibia. Ahora, inserte su nariz en una máscara nasal para suministrar oxígeno e isoflurano, un anestésico. Con una tijera, haga una pequeña incisión y corte el tejido. Tire suavemente del bazo junto con el páncreas y localice la cola pancreática.

Cargue una jeringa con suspensión fluorescente de células cancerosas e inyéctela suavemente en la cola pancreática. Aparece una burbuja superficial en el sitio de inyección que confirma el éxito de la implantación. Vuelva a colocar los órganos en la cavidad corporal y use una sutura estéril para cerrar la incisión. Ahora, regrese el mouse a una jaula y vigílelo hasta la recuperación.

Después de la duración deseada, coloque el mouse en una cámara de imágenes y tome imágenes. El haz de luz incide en las células cancerosas y excita la GFP, que, a su vez, produce una fluorescencia verde. En el siguiente protocolo, realizaremos la implantación quirúrgica de células de cáncer de páncreas que expresan GFP en un modelo de ratón murino ortotópico.

Para implantar las células, primero, aplique ungüento en los ojos de un ratón anestesiado y coloque al animal en una almohadilla térmica cubierta con un paño estéril. Luego, desinfecte suavemente el flanco del animal con tres exfoliantes de yodo seguidos de tres enjuagues con etanol al 70%. Después de confirmar la falta de respuesta al pinzamiento de la punta del pie, cargue aproximadamente 200 microlitros de las células preparadas en una jeringa TB de 1 mililitro preenfriada equipada con una aguja de calibre 18.

Reemplace la aguja de calibre 18 por una aguja de calibre 27 y vuelva a colocar las celdas en hielo. Luego, ubique el área general del bazo en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Con unas pinzas, pellizque la piel por encima del bazo y haga una incisión de aproximadamente 1 centímetro para crear una bolsa. A continuación, pellizca el músculo liso en la parte superior del bazo y corta el tejido para acceder a la cavidad peritoneal.

A continuación, agarre suavemente el extremo caudal del bazo y sáquelo de la cavidad corporal. Con un hisopo de algodón estéril húmedo, extienda el páncreas unido al extremo del bazo para ubicar la cola pancreática. Administra 50 microlitros de las células en la cola pancreática. Luego, gire lentamente la aguja fuera del páncreas.

Una implantación exitosa se verá como una burbuja superficial sin fugas. Regrese los órganos a la cavidad peritoneal y encierre todo con el músculo y la piel. Luego, use una sutura 6-0 para cerrar la incisión. Después, inyecte ketoprofeno a los animales y vigílelos hasta que se recuperen por completo. En el momento experimental apropiado, utilice un sistema comercial de imágenes de animales pequeños para obtener imágenes del crecimiento tumoral en el animal vivo bajo anestesia y seleccione los filtros de excitación y emisión adecuados.

A continuación, obtenga una imagen inicial utilizando solo luz blanca. Manteniendo al animal en la misma posición, cambie a los filtros GFP y adquiera una segunda imagen. Para analizar el crecimiento tumoral, superponga las imágenes blancas y fluorescentes para evaluar el área fluorescente y la intensidad de las células tumorales.