JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 4:24 min • April 30th, 2023
- El ganglio de la raíz dorsal o DRG son neuronas sensoriales que transmiten mensajes desde la periferia al sistema nervioso central. Por el contrario, las neuronas del plexo mientérico están involucradas en los movimientos peristálticos de los intestinos.
En enfermedades oncológicas como el cáncer de páncreas, estas neuronas se alteran morfológica y funcionalmente. Para estudiar los cambios en la morfología neuronal, se siembran las células neuronales en cubreobjetos prerrecubiertos con proteína laminina, colocados en una placa multipocillo, y se cubren las células con el medio basal neural.
La proteína laminina promueve el crecimiento de neuritas. Incuba las células durante la noche. A continuación, agregue el medio de extracto de tejido de cáncer de páncreas a los tres primeros pocillos y el medio de extracto de tejido pancreático sano a los tres pocillos siguientes. Incuba la placa. Ahora, realice la tinción inmunohistoquímica utilizando marcadores de anticuerpos específicos de neuronas, que se unen a las neuronas. Coloque el cubreobjetos en el portaobjetos de vidrio y coloque el portaobjetos bajo un microscopio invertido. Mida la densidad de neuritas con el software.
Las neuronas DRG cultivadas en el extracto de tejido de cáncer de páncreas suelen mostrar una mayor densidad de neuritas que en el extracto de tejido pancreático sano. Por el contrario, las neuronas del plexo mientérico forman neuritas más largas que en los extractos de tejido pancreático sano. En el siguiente protocolo, realizaremos un ensayo de neuroplasticidad in vitro en las neuronas DRG y del plexo mientérico de un ratón recién nacido.
- Para preparar las células para el cultivo, use un hemocitómetro para estimar el número total de neuronas y glía. A continuación, siembre las células en cubreobjetos de 13 milímetros prerrecubiertos en una placa de 24 pocillos. El recubrimiento utilizado depende de los objetivos experimentales. A continuación, cubra los pocillos con medio basal neural y permita que las células se adhieran a los pocillos, durante la noche. Al día siguiente, descongele el medio suplementado con extracto de tejido o el medio suplementado con sobrenadante de línea celular.
A continuación, aspire el medio de siembra de los GRD y realice un lavado opcional muy suave con PBS. A continuación, pipetee lentamente el medio suplementado con extracto de tejido o el medio suplementado con sobrenadante de la línea celular sobre las células para producir 100 microgramos por mililitro. Ahora, deje que las células crezcan durante 48 horas a 37 grados centígrados en el extracto de tejido o en el medio suministrado por el sobrenadante de la línea celular. Después de 48 horas, aspire el medio y fíjelo en paraformaldehído al 4% para la inmunotinción.
Para la tinción inmunofluorescente doble, utilice marcadores específicos de neuronas y glía. Para la morfometría, utilice un microscopio de luz invertida equipado con una cámara CCD en combinación con un software automatizado para medir la densidad de neuritas. Con un aumento de 200X, mida la densidad de neuritas de los cultivos neuronales superponiendo una cuadrícula de 50 X 50 micras y contando la densidad de fibras por cuadrado, medida en las fibras que se intersectan. Repita este análisis para cuatro regiones diferentes de crecimiento más denso en cuatro o cinco fotomicrografías representativas en cada cubreobjetos.
Mida el crecimiento de las neuritas, el número medio de ramas por neurona, la longitud media de las ramas y el tamaño pericarioal de 30 neuronas solitarias seleccionadas al azar de cada cubreobjetos marcando las neuritas y el pericario.