Detección de ROS con tinción DCFH-DA: medición de ROS totales en líneas celulares de cáncer colorrectal

- Las especies reactivas de oxígeno se producen predominantemente a partir de las mitocondrias cuando los electrones se escapan de la cadena de transporte de electrones. Estos electrones se combinan con el oxígeno molecular dando lugar a varias especies de oxígeno reactivo, o ROS. En las células cancerosas, hay una sobreproducción de especies reactivas de oxígeno. Estas moléculas ROS altamente reactivas pueden dañar oxidativamente las membranas, las proteínas y el ADN dentro de la célula.

El aumento de los niveles de ROS daña el ADN, lo que conduce a la activación de una vía de señalización oncogénica que causa la progresión del cáncer. Por lo tanto, es vital detectar los niveles de especies reactivas de oxígeno producidas por las células cancerosas.

Comience tomando células cancerosas de cáncer colorrectal humano en un medio de cultivo apropiado. A continuación, siembre estas células en una placa de pocillos múltiples y agregue la solución de DCFH-DA. Incube la placa durante el tiempo deseado. El DCFH-DA atraviesa la membrana celular. Una vez dentro de la célula, la DCFH-DA se convierte en DCFH en presencia de una enzima esterasa celular. Además, la oxidación de DCFH por especies reactivas de oxígeno produce moléculas fluorescentes verdes.

Observe las células bajo un microscopio fluorescente. La intensidad de la fluorescencia verde indica el nivel de especies reactivas de oxígeno en la célula. En el siguiente protocolo, utilizamos el colorante DCFH-DA para teñir las especies reactivas de oxígeno en las células de cáncer colorrectal.

- Para teñir las células, retire el medio que contiene el medicamento y lávelas una vez con DMEM. Agregue 500 microlitros de solución de trabajo DCFH-DA en cada pocillo e incube la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, retire el DCFH-DA de los pocillos y lávelos dos veces con DMEM y una vez con PBS.

Luego, agregue 500 microlitros de PBS a cada pocillo. Utilice el canal de proteína fluorescente verde en el microscopio de fluorescencia para tomar imágenes representativas de las células. A continuación, retire el PBS y añada 200 microlitros de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación a cada pocillo.

Incubar la placa en hielo durante cinco minutos y recoger los lisados celulares en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 21.130 x g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Luego, transfiera 100 microlitros del sobrenadante a una placa negra de 96 pocillos. Utilice un lector de microplacas con una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 530 nanómetros para medir la fluorescencia en cada pocillo.

A continuación, mida la concentración de proteínas con el ensayo de Bradford transfiriendo 1 microlitro del sobrenadante a una placa transparente de 96 pocillos con 100 microlitros de solución de ensayo de proteínas. Utilice las concentraciones de proteínas para normalizar las intensidades de fluorescencia.