Extracción de miARN circulante: un método para aislar miARN de muestras de plasma mediante extracción orgánica y enriquecimiento de ARN pequeño

- Los microARN o miARN son pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica degradando el ARNm o bloqueando su traducción en proteínas funcionales. Los miARN circulantes son posibles biomarcadores de cáncer y se pueden extraer de fluidos corporales como el plasma. Para empezar, mezcle el plasma con una solución desnaturalizante que homogeneice simultáneamente la muestra e inhiba las ribonucleasas que degradan el ARN.

Tratar con fenol-cloroformo ácido y centrifugar para separar la muestra en dos fases, una fase orgánica inferior que contiene ADN y proteínas, y una fase acuosa superior que contiene ARN. Recuperar la fase acuosa. Agregue etanol absoluto para precipitar el ARN de la solución.

Lleve la concentración de etanol de la muestra al 25% para establecer una condición inicial propicia para una gran separación de ARN. Transfiera la mezcla a un cartucho de filtro preensamblado y a una centrífuga. Los ARN grandes se inmovilizan selectivamente en el filtro, mientras que los miARN más pequeños se acumulan en el filtrado.

Posteriormente, aumentar la concentración de etanol al 55% para favorecer el aislamiento de miRNA. Transfiera el filtrado a un nuevo cartucho de filtro y centrífugo para atrapar los miARN. Coloque el cartucho en un tubo colector y añada un tampón de elución adecuado. Centrífuga para eluir los miRNAs en el tubo. En el siguiente protocolo, mostraremos el aislamiento circulante de miRNA del plasma de pacientes con cáncer colorrectal.

Para comenzar, transfiera 400 microlitros de la muestra de plasma a un tubo de 2 mililitros libre de ARNasa. Luego, agregue 400 microlitros de solución desnaturalizante al tubo. Agregue 4 microlitros de 1 pico nanomolar.

Después de mezclar la solución, agregue 800 microlitros de fenol-cloroformo ácido. Agite la solución en vórtice durante 60 segundos y centrifuga a máxima velocidad durante 15 minutos. A continuación, transfiera el lisado contenido en la fase acuosa superior a un tubo limpio, teniendo cuidado de no perturbar la interfase.

Mida el volumen de la fase acuosa recuperada y agregue 1/3 del volumen de etanol al lisado. Luego, coloque un cartucho de filtro en un tubo de recolección nuevo. Transfiera hasta 700 microlitros de la mezcla de lisado de etanol al cartucho de filtro. Centrifugar el cartucho filtrante durante 30 segundos a 10.000 x g.

A continuación, mida el volumen total del flujo de paso. Luego, agregue 2/3 del volumen de etanol al filtrado y mezcle bien. Coloque un segundo cartucho de filtro en un tubo de recolección nuevo. A continuación, transfiera hasta 700 microlitros de la muestra al cartucho y centrifugue a 10.000 x g durante 30 segundos antes de desechar el flujo.

Agregue 700 microlitros de solución de lavado de microARN al cartucho de filtro y centrifugue con un tubo de recolección a 10,000 x g durante 15 segundos. Deseche el flujo y vuelva a colocar el cartucho de filtro en el mismo tubo.

Después de esto, mueva el cartucho de filtro a un nuevo tubo de recolección. A continuación, añada 100 microlitros de solución de elución precalentada al cartucho. Centrifugar el cartucho de filtro a 10.000 x g durante 30 segundos para recuperar los microARN.

• MicroRNAs - Small non-coding RNAs that regulate gene expression.
• Circulating miRNAs - miRNAs in body fluids used as possible cancer biomarkers.
• Denaturing Solution - Homogenizes the sample and inhibits RNA-degrading ribonucleases.
• Acid phenol-chloroform - Used to separate the sample into distinct phases.
• Elution Buffer - A solution added to elute miRNAs into a collection tube.

• Introduce MicroRNAs - Small molecules regulating gene expression (e.g., mirna).
• Key Concepts – Summarize the roles and potential of miRNAs in cancer research (e.g., mirna plasma kit).
• Underlying Mechanisms – miRNAs are isolated using specific procedures (e.g., mirvana isolation kit).
• Connect to Experiment – The study utilizes miRNA isolation from plasma samples.

• What are MicroRNAs and how to extract them (using mirna extraction kits)?
• How does the process of miRNA isolation work (using mirvana paris kit)?
• What is the role of circulating miRNAs in cancer research?

• Practical Applications – miRNAs in diagnostics, research, and treatment (e.g., micro rna isolation).
• Industry Impact – Impacting biotech, healthcare sectors (e.g., s1122-1830).
• Societal Importance – Potential benefits in early disease detection (e.g., miRNA isolation protocol).
• Link to Scientific Advancements – Emergence of advanced extraction kits (e.g., mirna plasma extraction kit).