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- El enriquecimiento ambiental, o EE, se refiere a las modificaciones en los parámetros de la vivienda para obtener efectos beneficiosos sobre diversas enfermedades como el cáncer. En un ratón portador de tumores, la EE activa el sistema inmunitario y reduce la inflamación, lo que en última instancia mejora la microbiota intestinal y la tasa de supervivencia. Para estudiar los cambios en la microbiota intestinal, añada la cantidad deseada de tampón de lisis de heces en un tubo que contenga las heces de ratón.
Centrifugar la muestra y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Agregue tampón de lisis de cloruro de guanidinio que desnaturaliza la DNasa y la RNasa. A continuación, agregue etanol y transfiera la muestra a una columna de centrifugación de sílice.
El etanol ayuda a que el ADN se una a la sílice. Centrifugar la muestra. Ahora, transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga nuevo y agregue un tampón de elución a la columna para eluir el ADN.
Centrifugar la muestra y desechar la columna. Transfiera la muestra a un tubo de PCR y realice una PCR para amplificar el ADN. Cargue el ADN en gel de agarosa y realice una electroforesis para cuantificar el tamaño del ADN microbiano. En el siguiente protocolo, aislaremos el ADN de las heces para analizar el efecto de la EE sobre la microbiota del colon en el ratón tumorigénico.
- Utilice un kit comercial para aislar el ADN microbiano de las heces siguiendo un protocolo de detección de patógenos en las heces. Al hacerlo, transfiera las muestras del congelador a menos 80 grados Celsius sobre hielo seco y péselas. A continuación, configure una PCR que amplifique el ADN microbiano como se describe en el protocolo de texto. A continuación, limpie los productos de reacción con perlas magnéticas.
Para la limpieza, primero, centrifugue brevemente la placa PCR del amplicón para extraer los productos de la reacción. A continuación, agite las perlas magnéticas para dispersarlas uniformemente y transfiera 20 microlitros alícuotas a cada pozo de reacción. Mezcle bien las perlas con la solución pipeteando todo el volumen lentamente 10 veces. Luego, deje que las cuentas se asienten durante 5 minutos.
A continuación, coloque la placa de PCR en un soporte magnético y espere 2 minutos a que los sobrenadantes se eliminen después de la recolección magnética de perlas. Luego, retire y deseche los sobrenadantes. A continuación, con el plato todavía en el imán, llene cada pocillo de cuentas con 200 microlitros de etanol fresco al 80 por ciento y espere 30 segundos. Luego, retire con cuidado el sobrenadante.
Repite este paso de lavado una vez y deja que las cuentas se sequen al aire durante 10 minutos. Ahora, eluya los productos de reacción de las perlas retirando la placa del soporte magnético y agregando 52,5 microlitros de Tris a cada pocillo. Mezcle completamente las perlas en la solución pipeteando todo el volumen lentamente 10 veces. A continuación, recoja las perlas en el soporte magnético como antes y transfiera 50 microlitros de los sobrenadantes a una placa de PCR limpia. Cubra la placa con un adhesivo transparente y guárdela a menos 20 grados centígrados hasta por una semana.