Marcaje de células organoides del CCR: un método para generar células organoides de cáncer colorrectal transducidas por lentivirus GFP

- Los organoides son construcciones celulares tridimensionales in vitro que se autoorganizan para imitar las características clave de los tejidos de su órgano de origen. Para comenzar el etiquetado, trate los organoides cosechados con un cóctel de enzimas proteolíticas y colagenolíticas para disociar las células en suspensión. Centrífuga para separar las células del sobrenadante que contiene enzimas. Deseche el sobrenadante. Disuelva el gránulo de células utilizando un medio que contenga vectores lentivirales. Estos virus recombinantes llevan la secuencia codificante de una proteína verde fluorescente o GFP.

Los virus se fusionan con las células y liberan su material genético y ciertas enzimas virales en el citoplasma. La transcriptasa inversa viral sintetiza el ADN viral complementario que se mueve hacia el núcleo del huésped. La integrasa viral ayuda a incorporar el ADN viral que contiene la secuencia GFP en el genoma del huésped. Cultive estas células transducidas en una matriz extracelular o en una placa de cultivo recubierta de ECM. Aspire el medio y centrifugue para recoger las células no adheridas. Vuelva a suspender las celdas en ECM adicional.

Superponga la suspensión en el cultivo adherente para promover la viabilidad celular. Una vez que la matriz se solidifique, agregue medio de cultivo e incube para facilitar la formación de organoides. Observar el cultivo bajo un microscopio de fluorescencia. Las células transducidas sintetizan proteínas fluorescentes verdes. Los organoides formados a partir de estas células muestran positividad para GFP. El siguiente protocolo demuestra la transducción lentiviral de GFP en células organoides de cáncer colorrectal derivadas del paciente.

- Después de 7 a 10 días de cultivo, separar los organoides mecánicamente con un raspador de células estéril y transferir los organoides a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para su centrifugación. Luego, vuelva a suspender los gránulos en 500 microlitros de PBS con golpecitos suaves para otra centrifugación. Para disociar los organoides del cáncer colorrectal, agregue 500 microlitros de solución de enzimas proteolíticas y colagenolíticas a los tubos y mezcle con golpecitos suaves.

Después de 10 minutos a temperatura ambiente, agregue 500 microlitros de medio suplementado con 1% de FBS a las células, y pipetee muy suavemente la suspensión celular varias veces para romper los organoides.

- El pipeteo suave de los organoides del CCR humano durante el paso es fundamental para mantener una formación de esferoides intacta en el cultivo.

- Centrifugar las células de nuevo y resuspender los pellets en 100 microlitros de 5x GFP lentivirus y 400 microlitros de medio fresco de cultivo de organoides de cáncer colorrectal.

- Es esencial infectar los organoides del CCR humano con un alto título de lentivirus GFP, especialmente para lograr una eficiencia de infección de casi el 100%.

- Ajustar el volumen de cada tubo para lograr una célula tumoral disociada de 5 por 10 a la quinta por cada 500 microlitros de concentración media, y colocar 500 microlitros de células en cada pocillo de una placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular artificial, como se demuestra. Después de 18 horas en la incubadora de cultivo celular, transfiera los sobrenadantes que contienen células flotantes a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros para la centrifugación, seguida de la resuspensión de los gránulos en 70 microlitros de matriz extracelular artificial por tubo en hielo.

Para mejorar la viabilidad de las células de cáncer colorrectal, superponga la matriz extracelular artificial que contiene células tumorales sobre los organoides tumorales en la placa de 12 pocillos y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos. Cuando el recubrimiento de la matriz extracelular artificial se haya solidificado, alimente los cultivos con 1 mililitro de medio de cultivo de organoides CRC fresco suplementado con FCS al 1% y devuelva las células a la incubadora de cultivos celulares durante tres días. Luego, observe las células infectadas mediante microscopía de fluorescencia para confirmar una positividad de GFP de casi el 100% y devuelva las células a la incubadora durante otros 4 a 6 días.