JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 5:19 min • April 30th, 2023
- Comience tomando un ratón mutante condicional anestesiado con un genoma modificado que porta secuencias específicas de reconocimiento de la enzima Cre-recombinasa llamadas inserciones LoxP que flanquean el gen supresor de tumores que se desea mutar. Exponer quirúrgicamente la cavidad abdominal. Localice el colon distal y pinza su porción superior. Inserte por vía transanal un tubo de grado médico y avance hasta el colon distal. Enjuague el colon con solución salina para eliminar cualquier materia fecal. Reemplace el tubo. Pinza la región inferior del colon para la segmentación. Inflar el segmento utilizando una solución de disociación celular adecuada. Esto perfora la barrera mucosa y aumenta la accesibilidad de las células de la cripta intestinal. Enjuague la solución de disociación.
A continuación, inyecte una suspensión adenoviral en el segmento del colon. Estos vectores virales modificados codifican enzimas Cre-recombinasa. El virus entra en la célula, libera su ADN en el núcleo y expresa las enzimas. Las proteínas reconocen las inserciones de LoxP en el genoma del huésped y catalizan la recombinación específica del sitio, inactivando así el gen supresor de tumores. Esta mutación de pérdida de función promueve la progresión del cáncer. Suturar la incisión y permitir que el ratón se recupere. Monitor para observar el crecimiento de tumores colorrectales aislados. El siguiente protocolo muestra la generación de un modelo de ratón de cáncer colorrectal por infección segmentaria de adeno-cre.
- Comience colocando un ratón anestesiado en posición supina y aplique ungüento en los ojos del animal. Coloque el ratón en una posición segura y luego confirme el nivel adecuado de sedación mediante un pellizco con los dedos de los pies. Realice una incisión de aproximadamente 15 milímetros en la línea media de la piel de la parte inferior del abdomen. Luego, use fórceps para agarrar la musculatura de la pared abdominal y haga una incisión cuidadosa en el músculo con unas tijeras para abrir la cavidad abdominal. Después de identificar el colon distal, sujete cuidadosamente el tejido con una pinza delicada de aproximadamente 15 milímetros proximal al ano.
A continuación, inserte un tubo de teflón flexible por vía transanal, avanzando con cuidado el tubo hasta que alcance la oclusión luminal y canule el tubo con una cánula de calibre 30. Conecte una jeringa estándar de 1 mililitro a la cánula y enjuague el colon con varios mililitros de solución salina normal hasta que se haya evacuado toda la materia fecal. Una vez que el colon distal esté vacío, reemplace el tubo de solución salina por un nuevo tubo de teflón y use una segunda pinza para ocluir el colon aproximadamente 3 milímetros distal a la primera pinza.
Con una segunda jeringa de 1 mililitro equipada con una cánula de calibre 30, inyecte cuidadosamente de 50 a 80 microlitros de tripsina-EDTA al 0,25% en el segmento de colon pinzado. El colon debe inflarse lo suficiente como para romper la barrera mucosa sin perforar el segmento de tejido pinzado. Después de 10 minutos, retire la pinza distal. A continuación, retira el tubo de tripsina y enjuaga el colon distal con 500 microlitros de solución salina normal.
Después de insertar un nuevo tubo de teflón, vuelva a pinzar el colon e infle el tejido con 50 a 80 microlitros de la solución adenoviral. Después de 30 minutos, retire las pinzas y el tubo y cierre la pared abdominal con suturas de rápida absorción 6-0. Cierre la piel con pinzas quirúrgicas para heridas y vigile al animal con una almohadilla térmica hasta que se recupere por completo.
Para controlar el crecimiento tumoral mediante colonoscopia, coloque al animal anestesiado portador de tumor en posición supina sobre una almohadilla térmica e inserte el endoscopio por vía transanal en el tracto intestinal. Infle suavemente el aire bajo control visual para distender el colon. Luego, empuje cuidadosamente el endoscopio hacia adelante hasta que se pueda identificar la lesión mucosa en el colon distal, guardando cada imagen endoscópica a medida que se adquiere para una evaluación posterior. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, retire lentamente el endoscopio y coloque el mouse en una almohadilla térmica de 38 grados centígrados hasta que se recupere por completo.